全基因测序（WGS）在肠杆菌科细菌中的应用研究

周子超，何岚，丁月平

（1.浙江中医药大学，浙江 杭州 310005；2.浙江中医药大学附属第二医院ICU，浙江 杭州 310005）

0 引言

全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）是通过新一代的生物信息技术，并结合新的模式识别方法和网络分析，来分析不同机体基因组间的结构差异手段来分析不同机体基因组间的结构差异、单核苷酸的多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）和核心基因组多位点序列（core genome multilocus sequence typing，cgMLS）。具有信息全面、精确、高通量及高分辨率等优点。且随着高通量测序技术的发展，测序成本的大幅降低，WGS检测技术得以迅速普及，并快速超越传统策略，成为当前群体进化、变异分析和功能基因挖掘的最主要研究策略，在细菌流行病学中得到了广泛的应用。

肠杆菌科细菌是临床上常见的条件致病菌，可致肺炎、泌尿道感染、腹膜炎，菌血症等疾病。随着碳青霉烯类等抗菌药物的广泛和不合理应用，细菌耐药性普遍增加，甚至出现了碳青霉烯类耐药，显著增加了临床治疗的难度，耐药菌的流行。因此，全面监测该类细菌的致病性、耐药机制和临床流行病学具有重要的意义。

本文将WGS在肠杆菌科细菌中的应用作一综述，以期为WGS在细菌流行病学中的应用提供理论参考。

1 全基因测序技术概况

全基因组测序技术现阶段应用主要包括第二代测序技术（NPS）和第三代测序技术。在第一代测序技术（Sanger法）成本和速度发展至极限却依然无法大规模应用的情况下，第二代测序法应运而生。2005年，454 Life sciences公司（现被Roche公司收购）首次基于焦磷酸测序法，以“边合成边测序”为核心，“片段-磁珠-读长”的形式，达成了“超高通量”——能同时测序几十万到几百万条DNA分子，由此开辟了第二代测序技术的先河。随着科技的不断创新，2011年，第三代测序技术以单分子荧光、纳米孔及实时记录为技术核心，在原有的化学的间接性检测基础上融入显微镜观察的直接性实时物理检测，测序效率提升了2万倍；在直接检测与读长增长的双重条件下，结合更为先进的设备与荧光技术，使得精确率高达99.9999%。

综上可知，每一代测序技术所基于的检测（标记）技术各不相同，即每一代诞生均为质的改变。三代测序技术在研究应用中不断发展，尤其是第三代测序技术，突破技术制约，使其在研究领域迅速普及，成为当前细菌群体进化、变异分析和功能基因挖掘的最主要研究策略，并在细菌流行病学中得到了广泛的应用。

2 WGS在肠杆菌科细菌中的应用

2.1 致病性研究及诊断应用

WGS具备高通量及高分辨率的特点，可更加精确、快速地应用于体液检测。因而WGS有望应用于消化系统、呼吸系统、生殖泌尿系统等疾病的临床致病机制及药物靶点研究，从而为其诊断及后续治疗提供新思路。

大肠埃希菌、志贺菌、沙门菌均是常见的肠杆菌科类消化系统致病菌。基于WGS的应用，研究发现大肠埃希菌O157：H7的基因组变异主要归因于某些噬菌体的动态性，使细菌菌株具有可变的毒力基因谱[1]；揭示了志贺菌的毒力因子具有协同致病机制[2]。

呼吸系统病原菌是医院内感染暴发的首要源头，其中耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌（KPC-KP）更是临床治疗攻克的难关。全基因组测序让KPC-KP的诊断和治疗有了新的进展：现已发现并确认了几株毒力基因高频率出现的分离株的基因序列[3]；浙江大学第一附属医院余威团队应用WGS模拟技术证明了磷霉素联合治疗对大肠埃希菌的体外抗菌作用[4]。

美国、英国、中国等各大医院发现临床WGS可快速揭示与临床症状对应的相关基因序列，极大地降低了诊断的假阴性率[5]。根据致病菌的基因序列的测定，提出诊断依据，并做出疗效评估，从而降低了医院内感染的发生率。

与传统的实验室检测手段相比，WGS可直接应用于血流中残存病原体DNA的检测，直接从液体血培养中收集抗性基因[6]，提供单种抗生素的敏感性测定及预测，避免了高抑制剂和人类细胞或DNA浓度对检测设备及技术的限制；比较分离培养物和尿液标本的WGS结果，直接从尿液中测序可以在多微生物样品中进行细菌鉴定，可以在一些培养阴性的样品中观察到了其他可能的致病菌株。

由于同一基因序列的可存在于多种菌株的全基因组序列中，利用WGS技术可以横向研究含同一基因的致病菌的发病机制，能够为临床标本提供相关信息，大大缩短诊断时间，相对延长治疗的黄金时间窗。WGS从基因遗传性层面出发探究病原体的致病机理，为疾病病因的诊断，新菌种致病性提供了新的理论依据，在一定程度上降低了传统检测手段从形态、成分检测上人为主观因素影响造成的假阳性率和假阴性率，客观地描述了致病菌的存在形式及所属类别，同步提高了准确度和可靠性。

此外，为了克服数据分析的障碍，已有研究开发了一种公开提供的生物信息工具[7]，这表明WGS已具备走出实验室，应用于临床的条件。

2.2 耐药机制研究

随着抗生素的广泛和不恰当应用及对医院内感染的逐步重视。使用全基因组测序仪对耐药菌和标准菌中耐药机制通路相关基因全序列及保守序列进行基因测序，计算机分析、识别已知基因与临床耐药相关的突变。由此，WGS可具象化挖掘出更罕见、多样化的耐药基因，提供多重耐药菌基因型，并能够准确预测抗性表型，成为检测细菌耐药突变的宝贵工具。

在近几年间，针对各耐药菌的测序已在发达国家快速开展：美国报告了第一个完全组装的产志贺毒素的志贺菌多药耐药全基因组序列[8]；汤姆·德曼报告了一种对所有26种抗生素都不敏感的肺炎克雷伯菌的基因组特征[9]；西班牙的一种罕见的碳青霉烯酶类型（IMP-8）被WGS鉴定为阴沟肠杆菌分离株[10]。由此可见，以基因突变为基础的耐药菌产生机制，已经可以从“基因层面”这一源头找到监测措施，证明了监测程序作为检测编码抗菌素耐药性的意外基因的有效工具的实用性。

面对多重耐药基因，传统分子研究技术需要分多次研究、拆分多个层次，从而不可避免的产生了针对性治疗的局限性。WGS根据“化整为零”再“化零为整”的作用原理，可通过大规模并联测序仪，同步对菌株实行全基因组序列多耐药检测，为后续的整体化治疗奠定基础。

2.3 流行病学研究

基于WGS的单核苷酸多态性分型和核心基因组多位点序列分型，通过全球同类致病菌基因的横向比对，加速了致病菌来源的测定速度，可达到及时阻断传染源的传播途径，加速疫情控制的目的。

有文献显示，近年英国多个地区应用WGS技术，迅速发现并切断地中海、以色列等地的饮食来源致病菌的传播途径，有效地控制了肠道性疾病疫情的大规模暴发[11-12]；通过对亚洲内外六个国家分离的60株耐环丙沙星的沙门菌进行基因组测序，发现在南亚地区识别的以导致个体患病的致病菌很可能正在推动目前环丙沙星耐药沙门菌的在洲际的激增[13]。在无性系和碳青霉烯酶基因的多样性上证明，产碳青霉属肠杆菌科在挪威地区的传播依然有限，其感染主要与出国旅行有关[14]。

与传统分子追踪技术相比，使用WGS进行的回顾性被动监测在告知治疗、识别区域流行病亚谱系方面具有实用价值，并为解释前瞻性的、地方性的疾病提供一个框架。现阶段，美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）等共享数据库中存在大约5200株肺炎克雷伯菌全基因组序列，这将有助于跟踪这些致命性病原体的全球传播[15]，表明将WGS应用于分子流行病学研究，可以更好地了解多药耐药菌株在世界范围内的传播情况，并可作为发现和确定现有和新现致病菌的一个强有力的监测工具。

3 结语

综上所述，全基因组测序能对菌株的多重耐药基因谱、毒力基因谱进行同步分析，可直接在体液中鉴定致病菌的血清型，并对其进行分子分型诊断研究。同时随着该技术在肠杆菌科细菌检测上的日渐成熟，已有公开的信息分析平台用于全基因组序列分析检测对照，成为了肠杆菌科全球防控的有力监测工具。而在其他致病菌中推广时也发现，WGS现阶段依旧存在基因谱构建不全，适用范围受限；技术成本高，生物信息分析标准化尚未实现；未知突变序列无法解释等不足。希望未来通过努力能将这一快速检测分型方法尽快应用于临床诊断及疾病防控，提高患者疾病的治愈率，提升国民生活质量。