陕西菜田2种粉虱数量结构及烟粉虱生物型鉴定

刘 晨，张伟兵，洪 波，张 锋，张淑莲，李英梅

(1.陕西省生物农业研究所，西安 710043；2.陕西省蚕桑园艺技术工作站，西安 710003)

温室白粉虱(TrialeurodesvaporariorumGennadius)与烟粉虱(BemisiatabaciGennadius)同属半翅目(Hemiptera)粉虱科(Aleyrodidaw)小粉虱属，2种粉虱形态相似，常混合发生[1]，为害多种蔬菜及园林花卉[2]。近年来，随着种植业结构的调整，设施农业面积增加，设施生态环境优越，有利于烟粉虱和温室白粉虱的越冬及其增殖，其发生日趋严重，已成为北方地区蔬菜、花卉、林果等生产中的重要害虫，可危害多种寄主植物，还可传播多种植物病毒[3-4]，暴发时给世界农业经济造成巨大损失[5]。烟粉虱作为一个快速进化的物种复合体[6]，其遗传特性极复杂，可分为多个不同的生物型，目前已知至少26个生物型[7]，其中B型和Q型是2种入侵性较强的生物型[8]，被世界自然保护联盟列入全球100种最危险入侵生物[9]。刘树生[6]对B型烟粉虱对土著烟粉虱的交配行为互作、入侵和取代土著烟粉虱的重要机制进行研究，B型烟粉虱可通过干扰土著烟粉虱的交配行为达到抑制取代土著烟粉虱种群。另有研究表明，Q型烟粉虱耐药性高于B型，这种耐药性机制主要与Q型烟粉虱具有的抗性可遗传性及P450基因过表达导致的解毒作用增强有关[10-11]。在这种耐药性的选择下，Q型烟粉虱有逐步替代B型烟粉虱的趋势[12]。不同种类粉虱及烟粉虱不同生物型具有一定的地理分布区域。而对于陕西菜田的烟粉虱生物型、烟粉虱与白粉虱的数量结构报道较少，本研究旨在明确陕西菜田烟粉虱和温室白粉虱比例组成及烟粉虱生物型的变化趋势、分布区域，为进一步探究烟粉虱的演替规律及早期预警、风险评估及制定防治策略提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 粉虱种群数量调查

1.1.1 陕西不同地区粉虱 于2014-2016年每年3月、5月、8月、11月的中旬在陕西渭南、咸阳、商洛、延安、榆林、汉中、安康等不同设施蔬菜种植区定点调查10个日光温室，日光温室均为8 m×70 m 的标准棚，每个棚室按 “Z” 型5点取样法取样，每样点依次选择20株黄瓜，每株取上、中、下3张叶片统计烟粉虱及白粉虱的数量。

1.1.2 不同种类蔬菜上粉虱 在陕西省大荔县设施蔬菜生产区，调查黄瓜、番茄、茄子、秋葵、西葫芦、辣椒、菜豆、南瓜、芹菜、苦瓜等10种蔬菜上烟粉虱和温室白粉虱的虫口数量，调查时间、方法同上。

1.1.3 不同种植模式的粉虱 在陕西省大荔县设施蔬菜种植核心区“大荔现代农业园区”，分别选露地、冷棚、日光温室各10个棚室(田块)调查黄瓜上粉虱数量，调查时间为5-9月，每隔10 d 调查1次、日光温室与冷棚调查方法同上。露地调查方法为5点取样法，田间取5个点，取样点间距为10 m，每个点20株，共100株，每株取上、中、下3张叶片统计烟粉虱及白粉虱的数量。

1.2 生物型鉴定

1.2.1 供试虫源 试验所用虫源为2016年从陕西阎良区、三原县、杨凌区、岐山县、凤翔县、大荔县、富平县、商州区、鄠邑区、宝塔区、安塞县、石泉县、汉滨区等13个县(区)采集的烟粉虱成虫，将采集到的成虫浸泡于无水乙醇中，-20 ℃冰箱保存，备用。

1.2.2 烟粉虱DNA的提取 提取方法按照康为世纪动物组织DNA提取试剂盒方法进行。

1.2.3 PCR扩增及检测 PCR扩增反应所用引物见表1。PCR反应条件为：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，进行35个循环，循环结束后72 ℃延伸5 min，反应产物置于4 ℃冰箱保存，备用。

表1 烟粉虱鉴定所用引物Table 1 Primers used for biotype identification of Bemisia tabaci

1.2.4 电泳检测 用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳缓冲液为1×TAE，电压为80 V，电泳结束后用Gelred染色，通过凝胶成像仪观察并记录结果。

1.2.5 测序及序列比对 将PCR产物送至苏州泓迅生物科技有限公司进行测序[双脱氧核酸终止法(Sanger 测序)，ABI 3730xl]。测序结果利用BLAST与GenBank中的序列进行同源性比较。下载世界不同地区烟粉虱种群基因序列，利用MEGA 6.0软件，采用邻接法(Neighbour-Joining, NJ)对序列进行系统发育树的构建。

2 结果与分析

2.1 陕西不同地区及季节粉虱种群比例组成

调查结果显示，陕西关中、陕南、陕北不同地区设施栽培黄瓜上均有烟粉虱和温室白粉虱的分布(表2)。从表2可以看出，不同地区种群组成比例不同，不同季节种群组成比例也不相同，但均以烟粉虱为优势种，占种群数的60.2%～100%。3-5月，各地均有温室白粉虱的分布，随着温度的升高，在8月的时候，大荔、鄠邑、丹凤、石泉白粉虱数量降为0，而到了11月份，由于温度的降低，白粉虱数量又趋于回升。就不同地区而言，临渭、大荔、泾阳、安塞、石泉、丹凤、鄠邑等县(区)烟粉虱种群所占比例较高，占种群75.2%～100%。洋县、洛南、榆阳等县(区)烟粉虱所占比例相对较低，占种群的55.5%～80.6%。随着时间的推移，烟粉虱所占比例不断提高，早春4月以前，烟粉虱所占比例相对较低，5月份以后烟粉虱所占比例较高，8月份左右所占比例最高。由于烟粉虱在陕西境内自然条件下不能越冬，其分布与设施农业种植分布密切相关，也呈斑块状不规则分布。

2.2 不同蔬菜作物粉虱数量比例组成

调查结果表明，在同一环境条件下，烟粉虱和温室白粉虱分布特点不同，烟粉虱在调查的10种蔬菜上均有分布，但在不同蔬菜作物上分布数量显著不同，其种群数量大小依次为茄子>黄瓜>番茄>秋葵>西葫芦>南瓜>辣椒>菜豆>芹菜>苦瓜，温室白粉虱在调查的10种蔬菜上仅在黄瓜、番茄、辣椒、菜豆、南瓜上有分布，其种群数量大小依次为番茄>黄瓜>辣椒>南瓜>菜豆。在共同为害的5种寄主中，番茄上烟粉虱与白粉虱的数量比例为83.3∶16.7，黄瓜上的数量比例为87.6∶12.4，辣椒上的数量比例为71.6∶28.4，菜豆上的数量比例为81.0∶19.0，南瓜上的数量比例为77.6∶22.4，白粉虱种群数量明显低于同一寄主上烟粉虱的数量(表3)。

2.3 不同种植模式粉虱种群比例组成

不同种植模式黄瓜上烟粉虱和温室白粉虱的数量比例随时间变化而不同(图1)，5-9月均有两种粉虱的为害，但均以烟粉虱占优势种群。烟粉虱的种群数量以温室中为最大，其次是冷棚和露地，且随着时间推移烟粉虱种群所占比例依次提高，7月达到最高，进入9月烟粉虱所占比例又趋于降低。白粉虱的种群数量以露地为最大、其次是冷棚和温室，且随着时间的推移白粉虱种群数量不断下降，8月降到最低值，进入9月白粉 虱种群数量又小幅回升。说明烟粉虱较白粉虱更能适应7-8月的高温环境，白粉虱对5月及9月的低温环境较为适应，2种粉虱的种群数量构成以烟粉虱为绝对优势种群。

表2 陕西不同地区粉虱种群组成比例Table 2 The population composition of gennadius sampled from differently areas in Shaanxi province %

注：数据系3 a调查的平均数。

Note: Data were represented as everage of 3 years.

表3 烟粉虱和温室白粉虱在不同蔬菜寄主上的种群比例组成(渭南大荔)Table 3 The population proportion of Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum Gennadius involved in vegetables damage in Dali, Weinan

注：小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Lowercase letters indicated significant difference (P<0.05).

2.4 烟粉虱生物型的鉴定

采用mtDNA-CO1分子标记技术鉴定陕西的阎良区、三原县、杨凌区、岐山县、凤翔县、大荔县、富平县、商州区、鄠邑区、宝塔区、安塞县、石泉县、汉滨区共13县(区)的烟粉虱成虫，所测样品均得到1条约303 bp的片段(图2)。mtDNA-CO1标记分子鉴定结果表明，陕西13个不同地区的烟粉虱均为Q生物型。

2.5 序列比对

将关中地区大荔县、陕北地区宝塔区及陕南地区石泉县的烟粉虱PCR扩增产物进行测序，序列在NCBI上进行Blast比对，结果显示，样品与GenBank登录号为HQ198759(美国CLM52Q型烟粉虱)、FN557454(意大利CamPo2Q型烟粉虱)等序列同源性高达99.8%(图3)，检测结果说明在陕西发生为害的烟粉虱均为Q生物型。

2.6 系统发育树构建

对陕西13个不同地区采集的烟粉虱样本采 用mtDNA-CO1分子标记技术鉴定其生物型，并在此基础上构建系统发育进化树。所检测的这13个烟粉虱种群mtDNA-CO1基因序列是相同的，简称为Q-SHX。下载国外不同地区代表性烟粉虱序列(表4)进行聚类分析，以温室白粉虱为外群，构建系统发育树(图4)。从图4可以看出，所检测到的Q-SHX种群烟粉虱与温室白粉虱的遗传距离较大，首先将两者区分。Q-SHX种群序列与B型烟粉虱的遗传距离也较大，可以明显区分开。从图中还可以看出，Q-SHX种群与已知的Q型烟粉虱聚为同一进化分支，由此可以确定，从陕西采集的烟粉虱种群为Q型烟粉虱。

图1 不同种植模式下烟粉虱与白粉虱种群数量Fig.1 The population composition of Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum Gennadius in different planting patterns

M.Marker;1～13分别为阎良区、三原县、杨凌区、岐山县、凤翔县、大荔县、富平县、商州区、鄠邑区、宝塔区、安塞县、石泉县和汉滨区 1-13 samples collected from Yanliang district, Sanyuan county, Yangling district, Qishan county, Fengxiang county, Dali county, Fuping county, Shangzhou district, Huyi district, Baota district, Ansai county, Shiquan county and Hanbin district, respectively

图3 扩增片段与CLM52Q和CamPo2Q生物型中 mtDNA-CO1基因的序列比对Fig.3 The alignment between the PCR products and gene sequence of mtDNA-CO1 from CLM52Q and CamPo2Q

表4 系统进化分析中引用的其他序列信息Table 4 Other host information in the phylogenetic analysis

图4 基于 mtDNA-CO1基因序列构建的烟粉虱种群系统发育树Fig.4 The phylogenetic relationships among the B.tabaci biotype based on the sequence of mtDNA-CO1 gene

3 小结与讨论

本研究结果显示，在陕西地区同时存在烟粉虱和温室白粉虱，不同地区、不同作物、不同种植模式数量结构差异显著，但均以烟粉虱为优势种，烟粉虱生物型鉴定结果显示陕西为Q型烟粉虱。

在陕西不同地区中以大荔、临渭、渭城、泾阳、鄠邑、高陵、丹凤、石泉、靖边等县(区)烟粉虱种群比例较高，种群数量占比在95%以上；临潼、商州、宝塔、安塞等县(区)次之，烟粉虱占比在85%左右；洋县占比最低，为67.2%。

不同寄主作物上烟粉虱与白粉虱的数量结构差异显著不同，烟粉虱在参试的10种蔬菜上均有为害，白粉虱仅在番茄、黄瓜、辣椒、菜豆、南瓜上为害。白粉虱种群数量明显低于同一寄主上烟粉虱的数量。

日光温室、冷棚、露地3种栽培模式条件下，烟粉虱的种群数量以温室中为最大，白粉虱的种群数量以露地为最大，烟粉虱较白粉虱更能适应7-8月的高温环境，白粉虱对5月及9月的低温环境较为适应，两种粉虱的种群数量构成以烟粉虱为绝对优势种群。

对陕西13个地区的烟粉虱种群的CO1基因序列检测结果表明，陕西的烟粉虱生物型均为Q型烟粉虱。由系统聚类树可见，陕西Q型烟粉虱与国外其他地区的Q型烟粉虱聚为一支。

烟粉虱和白粉虱是先后入侵中国的重要害虫，两者的形态、为害特征及生活史非常相似、生态位重叠普遍，两者的种群动态及相互之间的影响关系十分复杂[13]。在寄主植物、季节活动时间的生态位竞争中，烟粉虱和白粉虱并未完全重叠，两种粉虱对寄主植物有不同的偏好性，白粉虱具有比烟粉虱更宽的温度范围，这一研究结果与褚栋等[14]对山东的粉虱种群动态分布研究结果一致。本研究结果表明，陕西境内不同地区的烟粉虱与白粉虱在长期的生态位竞争过程中，烟粉虱作为绝对的优势种群，但并未完全取代白粉虱。烟粉虱作为一个由多种生物型组成的复合种[15-19]，在不同区域的生物型分布是不均匀的。赵瑞华等[20]在2015年的研究结果表明， B型和Q型烟粉虱是陕西地区的主要生物型，其中B型烟粉虱占所测总样本的78.85%，但Q型种群比例在增长，结合本研究对陕西13个地点的烟粉虱生物型鉴定结果，说明Q型烟粉虱在陕西的扩散速度非常快，目前已经取代B型烟粉虱在陕西的分布。Q型烟粉虱在关中地区的种群数量更大，烟粉虱不同生物型在寄主范围、传毒能力、地理分布及抗药性等方面存在显著差异[21-22],研究明确不同地区粉虱的数量结构和种群比例对科学、合理的进行综合防控具有十分重要的意义，本研究初步明确陕西地区的烟粉虱与白粉虱的数量结构和烟粉虱的生物型，对陕西地区的防控提供理论依据。