海鲜菇蛋白质提取条件的优化

◎ 金周雨，丁 淼，康 骁，荆 波，高玉涵，国 微，宋 慧

（1.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春 130118；2.吉林北华大学理学院，吉林 吉林 132013）

海鲜菇隶属担子菌门层菌纲伞菌目白蘑科玉蕈属，又被称为玉蕈、斑玉蕈、鸿喜菇、真姬菇等，是目前风靡食用菌市场的珍稀菇种之一[1]，在日本享有“闻则松茸，食则玉蕈”的美誉。海鲜菇不仅质地极为爽脆，而且味道也极为鲜美，近年来在日本被广泛用作食品或调味品[2]。海鲜菇不仅含有对人体有益的黄酮和酚类等营养成分，是一类富含矿质元素的低热量、低脂肪、高蛋白的大型食用菌[3]，而且还具有抗炎症、抗氧化、抗肿瘤、提高机体免疫力等功效[4-5]。目前，在人工栽培和活性成分的鉴定是国内外学者对海鲜菇研究的重要方面，而对海鲜菇主要营养成分的利用和深度开发比较欠缺。本实验选取海鲜菇为实验材料，通过单因素试验和正交试验优化海鲜菇蛋白质的提取条件，为海鲜菇进一步开发和应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

海鲜菇，由吉林农业大学菌物所提供。

1.1.2 试剂及配制

①考马斯亮蓝G-250溶液。考马斯亮蓝G-250粉末0.10 g精确称取于含有50 mL 95%乙醇的烧杯中，加入100 mL 85%磷酸试剂，充分溶解后加水定容至1000 mL，混匀过滤备用。②标准蛋白质溶液（0.1 mg·mL-1牛血清白蛋白）。精确称取牛血清蛋白25 mg，加蒸馏水充分溶解后定容至100 mL，吸取定容好的溶液40 mL，用蒸馏水稀释至100 mL即为标准蛋白质溶液。

以上所用试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

主要仪器设备见表1。

表1 实验仪器表

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线的绘制

取出6支试管，然后将试管分别编号为1、2、3、4、5、6，再依次往试管中吸取标准蛋白质溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，加入蒸馏水至1.00 mL，然后加入5.00 mL考马斯亮蓝G-250溶液，振荡混匀后，室温条件下反应5 min，于波长595 nm处测定吸光度值，以蛋白质含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 样品提取液的蛋白质含量测定

样品提取液中蛋白质含量测定应用考马斯亮蓝法。蛋白质提取含量按公式（1）的计算。

式（1）中，W0表示根据标曲计算的蛋白质含量值，单位μg；VT表示提取液总体积，单位mL；W1表示样品干重，g；VS表示测定时加样量，mL。

1.3.3 计算海鲜菇蛋白质提取率

通过凯式定氮法(GB 5009.5-2016)[6]测定样品的总蛋白，按公式（2）计算海鲜菇蛋白质提取率。

式（2）中，MK表示样品提取的蛋白质质量，单位mg；MZ表示样品测得的总蛋白质质量，单位mg。

1.3.3.1 海鲜菇蛋白质提取的单因素实验

（1）单因素实验中提取温度的确定。在海鲜菇蛋白质提取时间和提取料液比处理条件不变的条件下，选择5个提取温度，筛选不同提取温度的蛋白质提取率。即当海鲜菇蛋白质提取时间为1.5 h，提取料液比为1∶60，提取温度分别为70、75、80、85 ℃和90 ℃时，进行海鲜菇蛋白质提取条件筛选。

（2）单因素实验中提取时间的确定。在海鲜菇蛋白质提取料液比和提取温度处理条件不变的条件下，选择5个提取时间点，筛选不同提取时间下的蛋白质提取率。即当海鲜菇蛋白质提取料液比为1∶60，提取温度为80 ℃，提取时间分别为0.5、1.0、1.5、2.5 h和3.0 h时，进行海鲜菇蛋白质提取条件筛选。

（3）单因素实验中提取时料液比的确定。在海鲜菇蛋白质提取时间和提取温度不变的条件下，选择5个提取料液比不同比例，筛选不同提取料液比的蛋白质提取率。即当海鲜菇蛋白质提取的时间为1.0 h，提取温度为80 ℃，提取料液比分别为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶70时，进行海鲜菇蛋白质提取条件筛选。

1.3.3.2 海鲜菇蛋白质提取的正交试验

根据单因素实验结果确定正交试验的方法，以海鲜菇蛋白质提取率为标准，设计三因素三水平正交试验表，以进一步对海鲜菇蛋白质的提取条件进行优化，见表2。

表2 正交试验各因素及水平表

2 结果与分析

2.1 海鲜菇蛋白质提取的标准曲线

以蛋白质含量（μg）作为横坐标，测得的吸光度（OD）值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=0.006 4X+0.011 8，R2=0.997 1，式中Y为吸光度，X为蛋白含量（μg）。线性关系良好。

图1 海鲜菇蛋白质提取的标准曲线图

2.2 单因素对海鲜菇蛋白质提取含量的影响

2.2.1 海鲜菇蛋白质提取条件中提取温度的影响

当海鲜菇蛋白质提取时间为1.5 h，提取料液比1∶60，提取温度分别为70、75、80、85 ℃和90 ℃，实验结果见图2。

图2 提取温度对海鲜菇蛋白质提取率的影响图

由图2可见，蛋白质提取率伴随着温度的升高先升高后降低，当温度为80 ℃时，蛋白质提取率最高。提取温度提高可以改进蛋白质的溶解性能，从而提高蛋白质的提取率；另外，在考虑蛋白质提取率的同时，也要兼顾蛋白质的品质，温度过高，蛋白质会变性失活。基于这样的分析，蛋白质提取温度不易定得过高。当海鲜菇蛋白质提取温度是80 ℃时，蛋白质提取率达到2.135%。

2.2.2 提取时间对海鲜菇蛋白质提取含量的影响

当海鲜菇蛋白质提取料液比为1∶60，提取温度80 ℃，时间分别为0.5、1.0、1.5、2.0 h和2.5 h，结果见图3。

由图3可见，海鲜菇蛋白质的溶出是当时间达到1.0 h时，蛋白提取率达到最高，而随着时间延长可能蛋白质降解造成蛋白质含量降低。当海鲜菇蛋白质提取时间为1.0 h时，蛋白提取率达到3.118%。

2.2.3 提取料液比对海鲜菇蛋白质提取含量的影响

当海鲜菇蛋白质提取时间为1.0 h，提取温度80 ℃，提取料液比分别为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶70，结果见图4。

由图4可见，海鲜菇蛋白质提取率伴随着溶液的增多先升高后降低，当料液比为1∶50时，蛋白质提取率最高。随着物料与溶液的接触面的增加，易于蛋白质溶出，而当料液比大于1∶50时，蛋白质提取率总体是下降的。当海鲜菇蛋白质提取料液比1∶50时，蛋白提取率达到3.950%。

2.3 正交试验优化海鲜菇蛋白质提取工艺

在单因素实验的基础上，进行正交试验进一步优化海鲜菇蛋白质热水浸提条件。正交试验的结果见表3。

正交试验的评价指标是蛋白质提取率。根据正交试验结果，判断工艺参数的影响大小为提取料液比（B）＞提取温度（C）＞提取时间（A）。最佳的工艺条件为A2B3C2的条件，即加热时间为1 h，海鲜菇粉与液体的比例为1∶60，提取温度为80 ℃，在此条件下海鲜菇蛋白质的提取率最大达到4.670%。

3 结论

①单因素实验中，当提取温度80 ℃时，蛋白质提取率最高，达到2.135%。②单因素实验中，当提取时间为1 h时，蛋白提取率最高，达到3.118%。③单因素实验中,当提取料液比1∶50时，蛋白提取率最高，达到3.950%。④正交试验表明，海鲜菇蛋白质提取最佳提条件为提取时间为1 h，料液比为1∶60，提取温度为80 ℃，在此条件下海鲜菇蛋白质的提取率是4.670%。

4 讨论

蛋白质是生物活性物质，在生物体中具有重要作用，是机体营养的主要来源。在动植物及菌类中含有较高的蛋白质成分。刘畅等[7]采用响应面法对北五味子水溶性糖蛋白提取工艺进行优化，发现最佳工艺条件是料液比1∶35（g·mL-1），碱提液pH为9.5，浸提温度35 ℃，浸提时间3 h时，糖蛋白提取率最高。在本实验中，对海鲜菇蛋白质的提取以蛋白质提取率为标准，所以在实验的设计中对温度、pH的条件设计范围比较宽。如果对蛋白质活性要求较高，不仅考虑提取溶液的酸碱度，而且提取温度不宜过高，否则可能会破坏蛋白质的二级结构，使其生物活性降低甚至破坏。