非洲猪瘟病毒免疫逃逸相关蛋白研究进展

王西西 陈青 陈鸿军 朱鸿飞 李金祥 郭晓宇

非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，AS-FV）是一种核质大DNA病毒，在病毒分类中隶属于DNA病毒目、非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属，为该病毒科唯一成员。ASFV具有双层囊膜结构，病毒基因组为线性双链DNA分子，不同毒株基因组大小存在一定差异，总体介于170～190 kb之间，可编码150多个开放阅读框，成熟病毒粒子中含有50种以上结构蛋白。

巨噬细胞是 ASFV感染的主要靶细胞，病毒主要通过肌动蛋白介导的内吞作用和巨胞饮作用进入巨噬细胞，随后病毒内层囊膜与次级内体融合，病毒核心被释放到细胞质中。ASFV主要在巨噬细胞内完成复制、组装及子代病毒颗粒的释放，病毒表达自身DNA聚合酶、连接酶和核酸内切酶等保证复制的准确性。已有研究表明，ASFV基因组可编码多种蛋白质，用以调控宿主细胞蛋白表达、干扰宿主天然免疫系统和调控细胞周期等，从而抑制和逃避宿主的免疫应答反应，为自身增殖、扩散创造有利条件。ASFV编码的免疫逃逸蛋白按功能主要分为以下几类：① 调控宿主细胞蛋白表达系统及细胞因子的转录，如DP71L和A238L等；② 抑制Ⅰ型干扰素信号通路，如多基因家族蛋白 MGF360、MGF505/530和 I329L等；③ 调控细胞程序性死亡，包括p54、A179L、A224L和EP153R等；④ 其他免疫抑制蛋白，如CD2v、L83L等。

1 病毒蛋白调控宿主细胞蛋白表达

1.1 DP71L

DP71L基因位于ASFV基因组右侧可变区，紧邻 ASFV毒力基因DP96R，是高度保守的晚期表达蛋白。大部分ASFV毒株的DP71L蛋白为短链（DP71Ls/NL-S，70～72个氨基酸），其他一些分离株（如ASFV Malawi Lil-20/1和pig/Kenya/KEN-50/1950毒株）的DP71L为长链蛋白（DP71Ll，184～185个氨基酸）。NL-S蛋白氨基酸序列同源性为94%～100%，DP71Ll蛋白118～185位氨基酸与NL-S蛋白7～71位氨基酸序列的同源性为 61%。NL-S和 DP71Ll都具有的保守 C端结构域，与单纯疱疹病毒毒力蛋白ICP34.5和生长抑制DNA损伤蛋白34（GADD34）的同源性为30%～40%。

eIF2是一种通用的真核翻译因子，是由α、β和γ亚基组成的异源三聚体，在病毒感染或蛋白质应激（ERS）等刺激发生时α亚基在eIF2激酶作用下发生磷酸化修饰，引起蛋白翻译受阻。ASFV编码的免疫逃逸蛋白NL-S和DP71Ll蛋白可募集蛋白磷酸酶 1（PP1），使翻译起始因子2α（eIF2α）去磷酸化以恢复蛋白合成，从而使得病毒利用细胞蛋白表达系统表达自身蛋白。

ASFV利用内质网（Endoplasmic reticulum，ER）进行蛋白表达与修饰，大量病毒蛋白表达造成未折叠蛋白质在内质网内积累，导致内质网应激（ER stress，ERS）。持久的内质网应激激活peIF2α-ATF4-CHOP信号通路，使细胞进入内质网应激诱导的凋亡程序。而ASFV表达的DP71L通过促进eIF2α去磷酸化，抑制 peIF2α-ATF4-CHOP信号通路的激活及其介导的细胞凋亡，以促进病毒在细胞内增殖。

ASFV E70缺失DP71L基因后对宿主的毒力明显下降，缺失病毒感染猪后除了短暂的发热反应没有出现其他临床症状，血液中病毒滴度能够降低1000倍，所有接种动物均未出现死亡。然而 ASFV Malawi Lil-20/1毒株（Mal）缺失DP71L基因后，在家猪中的致死率仍达100%；ASFV Pretoriuskop/96/4毒株（Pr4）缺失DP71L基因后，能够延迟家猪接种后出现病毒血症及死亡的时间，但致死率仍然很高。以上研究表明：DP71L基因是ASFV非必需毒力基因，Mal和 Pr4缺失 DP71L基因后仍有其他补偿性基因以维持病毒毒力。

1.2 A238L

A238L为ASFV早期表达蛋白，分子量大小约为28 kD，含有226～239个氨基酸，是ASFV在巨噬细胞中复制的非必需蛋白。A238L包含一个锚蛋白重复序列（Ankyrinrepeat，ANK），为IkappaB蛋白同系物，与猪IκBα因子同源性为40%。A238L能够抑制NF-κB转录因子的活化，进而抑制促炎性因子的表达，并调控NF-κB通路下游一氧化氮合酶、粘附分子和补体因子等蛋白的表达与活化。ASFVE-70毒株缺失A238L基因后，感染猪PBMC可诱导TNF-α显著上调表达。A238L通过其结构域竞争性地占据钙调神经磷酸酶（Calcineurin，CN）底物结合位点，抑制CN与底物结合，进而抑制CN对T细胞核因子蛋白（NFAT）进行脱磷酸化，阻碍 NFAT向细胞核内转移，实现对生理活动的调节作用。此外，A238L蛋白抑制 iNOS启动子活性，下调iNOS表达及其诱导的抗病毒反应。

2 病毒蛋白抑制Ⅰ型干扰素信号通路及NF-κB信号通路

2.1 多基因家族蛋白MGF360、MGF530/505

ASFV基因组结构分为左右两侧可变区和中央保守区，中央保守区几乎不出现大片段的插入和缺失突变，左右两侧可变区内串联排列的多基因家族基因在不同的毒株中具有不同的拷贝数和互补性。位于可变区的多基因家族蛋白主要分为5种：MGF100、MGF110、MGF300、MGF360和MGF505/530，在不同的毒株中MGFs具有不同的拷贝数和序列多样性。与痘病毒类似，ASFV基因组多样性来源于两端基因组的多样性，通常基因组两侧可变区的基因对病毒体外增殖是非必需的，而是参与抑制宿主Ⅰ型干扰素（Interferon，IFN）产生和调控促炎性细胞因子表达等功能。

已有研究表明，MGF360、530/505能够抑制I型干扰素表达，同时抑制干扰素的抗病毒效应，并通过延长感染细胞的存活时间来提高病毒在宿主细胞中的增殖效率和数量。MGF360家族成员A276R可以抑制Poly（I：C）刺激的I型干扰素上调表达，而对 I型和 II型干扰素诱导的JAK-STAT途径和NF-κB信号通路没有抑制作用。MGF505家族成员A528R可以抑制Poly（I：C）刺激的IFN诱导表达，同时对I型和II型干扰素诱导的JAK-STAT途径具有抑制作用。ASFV弱毒株OURT88/3缺失MGF360-10L、11L、12L、13L、14L和MGF530/505-1R、2R及部分MGF530/505-3R后，与母本病毒相比，MGF基因缺失毒株可以在体内和体外诱导产生较高水平的IFN，且可提供针对同源基因I型和其他基因型的攻毒保护。AS-FV强毒或弱毒株缺失MGF360和530/505后在巨噬细胞或软蜱体内的复制效率下降，病毒毒力下降，免疫动物后可以提供针对同源病毒或部分异源病毒的保护力。

2.2 I329L

I329L蛋白是ASFV晚期蛋白，含有329个氨基酸，序列相对保守。I329L为高度糖基化的 I型跨膜蛋白，分布于感染细胞的细胞膜以及病毒囊膜表面。I329L包含信号肽（1～17 aa）、N-末端的细胞外结构域（18～239 aa），跨膜结构域（240～260 aa）和 C末端的细胞内结构域（氨基酸261～329 aa）。ASFV I329L为TLR家族蛋白同系物，其胞内区氨基酸序列与TLR3的BOX1和BOX2序列相似性可达 35%，胞外区结构域富含亮氨酸的重复序列（LRR），LRR在几种 TLRs中均有存在，是蛋白质之间相互作用的重要基序。

研究表明，I329L可拮抗TLR3介导的固有免疫激活，抑制dsRNA/Poly（I：C）刺激后诱导的NF-κB和 IRF3信号通路。TRIF是TLR信号通路中的关键接头蛋白，是I329L调控免疫系统的靶蛋白。对I329L的构象研究表明，该蛋白能够抑制接头分子TRIF的活性，进而阻断TRIF介导的 IRF3和 NF-κB激活以及下游细胞因子的转录，过表达TRIF可以逆转I329L的抑制作用。

3 病毒蛋白调控细胞凋亡

3.1 病毒蛋白抑制细胞凋亡

3.1.1 A179LA179L蛋白在病毒感染早期和晚期均有表达，分子量大小约为18 kD，含有179个氨基酸，在不同的ASFV毒株中A179L序列高度保守。A179L是Bcl-2家族成员之一，具有Bcl-2家族成员保守结构域 BH1、BH2、BH3和 BH4，但缺少相应跨膜结构域。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡过程中起重要作用，主要分为两大类：一类抗细胞凋亡，主要包括Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1、CED9等；一类促进细胞凋亡，主要包括Bax、Bak、Bcl-XS、Bad、Bik、Bid等。

研究表明，A179L主要定位在线粒体或内质网。在多种细胞系中表达A179L后均能抑制细胞凋亡。例如，A179L抑制p68诱导的HeLa和BSC-40细胞凋亡，以及大分子诱导的BSC-40细胞凋亡。A179L能够抑制重组杆状病毒感染单层生长昆虫细胞而非悬浮培养细胞的凋亡，表明A179L抗细胞凋亡活性可能与细胞锚定特性有关。

Galindo等证明A179L可以与促凋亡的仅表达BH3的截短活性蛋白Bidp13和p15相互作用，抑制其活性；A179L还可以与促凋亡蛋白家族的其他蛋白如 Bad、Bmf、Bik和Bim等相互作用，形成异源二聚体，使得细胞不进入凋亡程序。此外，A179L还通过与 Beclin-1互作调节细胞自噬，并抑制饥饿条件诱导的自噬体的形成。

3.1.2 A224LA224L蛋白具有224个氨基酸，在不同的AS-FV毒株中序列相对保守，同源性为90%～99%。A224L在ASFV感染细胞晚期表达，是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）家族蛋白成员。IAPs是内源性抑制细胞凋亡的蛋白质家族，其显著结构特征是均具有1～3个杆状病毒重复结构（baculorius IAP repeat，BIR）结构域。人的IAPs包括XIAP和cIAP1等，XIAP与caspase-9、caspase-3和caspase-7相互作用，抑制它们的活化以及其所介导的细胞凋亡。

在细胞中稳定表达A224L蛋白能够抑制TNF-α诱导的caspase3激活及细胞凋亡，具体机制涉及对caspase-3蛋白水解的抑制，可能通过A224L与caspase-3蛋白水解片段的直接互作，从而干扰细胞凋亡路径，促进ASFV感染细胞的存活。Vero细胞感染A224L基因缺失病毒后，caspase-3的蛋白水解作用显著增加。此外，有研究表明细胞瞬时表达A224L后能激活NF-κB信号通路，NF-κB具有抑制细胞凋亡并促进宿主细胞增殖的功能，对病毒在细胞内增殖具有促进作用。ASFV在不同感染时期对 NF-κB具有不同的调控机制。在病毒感染早期，ASFV表达A238L对NF-κB信号通路产生抑制作用；随着感染进程的推进，ASFV表达晚期蛋白A224L，激活NF-κB通路并抑制caspase活性及细胞凋亡。

3.1.3 EP153REP153R编码含有153～163个氨基酸的凝集素类似膜蛋白，EP153R与一些C型凝集素分子的 N-端结构域具有同源性。EP153R在病毒感染期间的早期和晚期均具有表达，为病毒在细胞增殖的非必需蛋白。EP153R含有中央跨膜区，C型凝集素样结构（C-type lectin）和细胞附着序列，蛋白中潜在多个N-糖基化、磷酸化和豆蔻酰化位点。

EP153R蛋白为多功能蛋白，能够调控细胞凋亡，抑制MHC-I表达，且参与 ASFV感染细胞后的血细胞吸附过程。用缺失EP153R基因后的ASFV BA71V毒株感染细胞，caspase-3表达水平及细胞死亡量显著增加。在Vero或Cos细胞中过表达EP153R后，p53蛋白的反式激活活性受到抑制，进而抑制星形孢菌素或病毒感染诱导的细胞凋亡。

Hurtado C等模拟了EP153R的3D结构，预测EP153R的二聚体可能与MHC-I分子具有相互作用。过表达和病毒感染实验表明，EP153R抑制MHC-I的表达，主要通过抑制MHC-I从内质网到细胞膜的胞外分泌过程，而不是影响MHC-I的表达及成熟过程。用缺失 EP153R的NH/P68毒株免疫动物后29 d后，可以提供针对同源病毒AS-FVL60的免疫攻毒保护。

3.2 感染后期诱导细胞凋亡

3.2.1 E183L E183L基因编码含有183～197个氨基酸的ASFV膜蛋白p54。p54为ASFV结构蛋白，参与病毒粒子组装，以及病毒粘附宿主细胞过程。过表达 ASFVE183L基因，可促进 caspase-3蛋白表达及核断裂，进而促进其介导的细胞凋亡。p54包含一个含有13个氨基酸的结构域，通过与胞质动力蛋白轻链相互作用，实现病毒在细胞质内进行转运；这些氨基酸序列与仅表达BH3的促凋亡蛋白的Bim结构域具有一定相似性，缺失该结构域后，p54便失去诱导细胞凋亡的能力。

4 病毒其他免疫抑制蛋白

4.1 CD2v

CD2v是ASFV晚期表达蛋白，在ASFV感染的细胞中，CD2v具有三种表达形式，分别为89kD的全长糖基化蛋白，及通过蛋白水解作用产生的大小约为63kD的N-末端糖基化片段和大小约为26 kD的C-末端非糖基化片段。ASFVCD2v与 T细胞和NK细胞表达的CD2结构与功能类似。CD2v蛋白能够导致红细胞吸附于病毒感染细胞表面，有助于其在宿主体内的扩散。此外CD2v具有抑制有丝分裂原刺激淋巴细胞增殖的作用，具体机制可能是通过CD2v细胞外结构域与淋巴细胞表面配体的直接相互作用，或通过CD2v细胞质中结构域与胞质蛋白相互作用而介导。EP153R与CD2v为相邻基因，缺失EP153R后病毒在细胞中的增殖不受到影响，但ASFV感染细胞所导致的血细胞吸附现象基本消失。缺失CD2v后的BA71毒株接种家猪后无明显临床感染症状，可以保护接种猪免受母本病毒的攻击，还可以提供针对E75（基因I型）以及 Georgia2007/1（基因 II型）强毒的攻毒保护。

4.2 L83L

L83L为ASFV早期表达蛋白，含有一个保守的异戊烯化基序，是病毒在巨噬细胞复制的非必需蛋白。L83L能够特异性结合IL-1β，抑制其抗病毒反应。Georgia 2007/1毒株缺失L83L基因后在巨噬细胞中的复制能力无明显变化，且基因缺失毒株具有与亲本 Georgia 2007/1相似的致病力。

5 讨论

针对入侵病原，机体进化出一系列高度复杂的免疫机制以预防和清除病原体。非洲猪瘟病毒（ASFV）是大DNA病毒，在巨噬细胞内快速增殖，进而扩散至全身，导致家猪在感染后 2～10 d内发病死亡。ASFV通过自身蛋白采用多种免疫逃逸机制以确保病毒的繁殖与扩散，从 ASFV毒株中缺失相关基因后，有助于构建具有良好免疫原性和保护力的多基因工程缺失疫苗。抑制 I型 IFN的产生及其抗病毒效应对于促进ASFV增殖至关重要，不同基因型的ASFV毒株缺失部分MGF360/505基因后，病毒毒力显著减弱。目前，对于多基因家族蛋白的作用机制及是否存在其他病毒蛋白抑制 I型 IFN信号通路仍是ASFV免疫逃逸机制研究的热点。

ASFV的p54结构蛋白是重要的促凋亡因子，在感染细胞早期即可促进细胞凋亡，但不利于病毒增殖，因此 ASFV感染初期表达多种抑制凋亡蛋白，如A179L、A224L、EP153R和DP71L等。延长感染巨噬细胞的存活及促进临近淋巴细胞的凋亡是ASFV完成增殖及免疫逃逸的重要机制，但ASFV如何调控自身蛋白表达，如何维持促进细胞凋亡与抗凋亡的平衡以完成病毒复制，以及如何在感染后期引起大量未感染淋巴细胞及非淋巴组织细胞的凋亡是今后研究中的重点。

ASFV具有复杂的基因结构，编码表达大量病毒复制非必需蛋白，这些蛋白的功能是什么?有些病毒蛋白具有相似功能，它们对病毒免疫逃逸和致病力有哪些影响？哪些细胞受体和宿主蛋白与病毒蛋白产生相互作用？这些问题仍有待进一步研究。深入研究ASFV病毒免疫逃逸机制必将有助于了解ASFV的致病机理，并对疫苗开发和疾病防控提供指导作用。

（摘自《病毒学报》2018年第6期）