非洲猪瘟病毒的分子病原学及致病机理研究进展

欧云文 阎传忠 张杰 马炳 代军飞 张永光 贾宁

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，通常表现出全身出血、呼吸障碍和神经症状等临床症状，具有病程时间短、高病死率等特征，给受灾国的养猪业造成严重的影响。1921年，非洲的肯尼亚首次报道了ASF疫情，随后非洲多个国家与地区先后出现疫情；1957年，ASF首次从非洲大陆传出，进入葡萄牙的里斯本地区；20世纪60至20世纪80年代，葡萄牙、西班牙、意大利、法国、比利时、荷兰、马耳他等欧洲国家及古巴、巴西、海地等加勒比地区也相继暴发ASF。2007年，ASF首次进入格鲁吉亚，随后疫情相继蔓延至亚美尼亚、俄罗斯和阿塞拜疆等高加索地区，甚至进入到东欧的波兰、拉脱维亚等地区，进而在该地区形成一个新的ASF流行区域，并出现向更大范围扩散的趋势。野猪、家猪和钝缘蜱是 ASFV的宿主，猪巨噬细胞是ASFV的靶细胞。目前缺乏有效的ASFV疫苗和治疗方法，因此，该病是世界动物卫生组织（OIE）法定报告的动物疫病之一，中国也将其列为一类动物传染病。病原学和致病机理研究作为动物病毒研究的重要内容，是研究动物疫病的理论基础。作者主要对ASFV的分子病原学和致病机理研究情况进行综述，以期为ASF的防控提供一定的理论依据。

1 分子病原学

ASFV是一种单分子线状双链DNA病毒，属于双链DNA病毒目，非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属，也是 ASFV家族中的唯一成员。病毒基因组末端以共价键闭合，长为170～190 kb，含有151个开放性阅读框（ORFs），可编码 150～200种蛋白质。基因组中央是长约 125 kb的保守区，左端48 kb和右端22 kb中间区域存在差异，这也是不同分离株的基因组长度存在差异的主要原因。采用限制性内切酶进行酶切，图谱分析表明，分离于美洲和欧洲的病毒株为同一个基因型，而分离于非洲的毒株则具有多种基因型，这进一步表明来自不同区域的毒株之间存在较大的基因型差异，来自非洲以外地域的ASFV可能有共同的起源。ASFV基因组变异频繁，表现出明显的遗传多样性，根据ASFVP72蛋白C端编码基因的序列，将ASFV分为22个基因型，即P72基因型Ⅰ～Ⅹ Ⅻ，如果根据P54和PB602L基因的中央可变区（CVR）进行遗传分析，可进一步细化P72基因分型。

2008年，坦桑尼亚暴发ASF疫情，通过对来自该地区的死亡家猪组织样品进行分析发现，该地区流行毒株为坦桑尼亚株（2008株），属于P72基因型ⅩⅤ，并与坦桑尼亚株（2001株）具有很高的同源性。2011年，Uttenthal等从坦桑尼亚无明显症状的猪样品中检测到ASFV的基因组，进行遗传分析后发现其与欧洲毒株基因具有很高的相似性，属于ASFV基因型Ⅱ（即格鲁吉亚2007/1株），由此推测该病毒可能是从欧洲国家传入坦桑尼亚，而非来自其他非洲国家。Atuhaire等同时对2010—2013年暴发于乌干达的ASFV进行遗传性相关分析，发现了两个新的CVR亚型。Luka等对来自尼日利亚2007—2011年的样本中ASFV的3个独立的基因组区域进行分析，发现在P72和P54基因区域没有变化，P72序列的系统发育树表明所有的尼日利亚株都属于基因Ⅰ 型，B602L基因分析结果表明四聚体重复数存在一定差异，这将为ASFV进化流行病学信息提供依据。Achenbach等采集埃塞俄比亚出现ASF疫情地区的23头家猪组织样品（2011—2014年），进行ASFV基因组分析，结果显示 ASFV的部分P72基因序列为一个新的基因型。与此同时，Gallard等发现在欧洲地区，尤其在高加索地区和俄罗斯发现的 ASFV分离株存在相同的P72、P54和CVR序列，这表明其来源于同一个ASFV毒株。Sanna等对长期流行于意大利撒丁岛的ASFV进行变量序列分析，发现该撒丁岛分离毒株的变异性较低，证实了该地区的毒株存在显著的遗传稳定性。2014年，Carmina等对流行于立陶宛和波兰的 ASFV进行检测，测序结果显示该毒株与白俄罗斯流行株（2013年）相似，与流行于东欧的毒株同源性为100%，但与格鲁吉亚分离毒株（2007株）存在一定差异性。李洪利等根据P72基因序列，设计引物和探针，优化反应条件，建立了ASFV实时荧光定量PCR检测方法，为 ASF的防控提供了一套有效的检测方法。与此同时，李洪利等采用 pET-32a原核表达系统表达了含有主要抗原表位区域的ASFV VP73蛋白（又名P72蛋白），并制备了多克隆抗体。柏丽华等将ASFVP72基因克隆入Bac-to-Bac系统中进行真核表达，并对其抗原性进行分析。Zhou等对ASFV与软蜱、猪之间的同义密码子使用的相似性程度及ASFV全基因组中病毒功能基因的翻译起始区域的同义密码子使用偏差进行统计分析，发现具有U/A末端的密码子在相同氨基酸的同义密码子家族中占主导地位；在密码子使用的相似性程度上，ASFV和软蜱之间的相似度高于病毒和猪之间的相似度，这表明在密码子使用模式方面，软蜱发挥了比猪更重要的作用。组织细胞适应株（西班牙BA71V分离株）是第一个被确定基因组全序列的毒株，该毒株常作为实验室研究的重要对象。目前，11株ASFV全基因组序列已被测定，其中1株为无毒力的西班牙BA71V分离株，1株为有毒力的西班牙E75分离株，1株低毒力毒株分离于葡萄牙软蜱体内，剩余 8株分离于非洲家猪或野猪体内。

ASFV是一种正二十面体对称结构病毒，病毒直径为200 nm，其中直径为70～100 nm的DNA核心位于病毒中间，直径为172～191 nm的二十面体的衣壳和含类脂的囊膜包裹着病毒外周；衣壳呈二十面体对称，由1892～2172个壳粒构成，中心有孔，呈六棱镜状，壳粒间的间距为7.4～8.1 nm。成熟的病毒粒子由多层结构组成，含有50多种病毒编码蛋白质，其中包括结构蛋白、基因转录和RNA加工所需的酶，这些蛋白是构成病毒粒子结构的主要成分，对病毒粒子的再次感染有重要作用；构成病毒粒子的结构蛋白有 P72、P49、P54、P220、P62、CD2v等，其中P72蛋白表达于ASFV感染晚期，位于病毒衣壳的表面，具有良好的反应原性和抗原性，是病毒二十面体衣壳的重要组成成分。P54蛋白位于病毒颗粒类脂外膜上，由病毒E183L基因编码，P54的差异表达可能会出现在细胞传代过程中；研究发现在该蛋白氨基末端含有跨膜区域，因此，P54蛋白在病毒感染过程中发挥重要作用，尤其在病毒蛋白经内质网膜转化成病毒包膜前体时发挥着非常重要的作用；P220和P62的正常加工是病毒粒子成熟的一个重要指标。CD2v与T细胞表面黏附因子CD2具有相似性，其能使病毒颗粒吸附于红细胞，同时该蛋白可损坏淋巴细胞的功能，研究发现，CD2v的表达影响ASFV在家猪间的传播。Borca等开发了具有HA标记的 Ep152R蛋白的重组ASFV（ASFV-G-Ep152R-HA），表明Ep152R是早期的病毒蛋白；发现开放阅读框Ep152R表征可预测补体控制模块/SCR结构域，痘苗病毒蛋白含有该结构域，该蛋白还参与病毒感染期间的阻断免疫应答；通过酵母双杂交筛选分析了宿主与Ep152R蛋白之间的相互作用，并鉴定了一种被认为是ASFV复制所必需的BAG6蛋白。

2 致病机理

2.1 ASFV与宿主动物的相互作用

家猪、野猪和钝缘蜱是 ASFV的主要宿主，其中呼吸道和消化道作为ASFV入侵的主要门户，病毒感染机体后，首先在扁桃体中进行增殖，伴随着血液循环而进入循环系统，引起病毒血症，并在血管内皮细胞或巨噬细胞中进行复制，病毒对毛细血管、动脉、静脉和淋巴结的内皮细胞进行侵袭，导致相应组织、器官出现出血、浆液性渗出、血栓和梗死等病理变化，以及出现淋巴细胞凋亡、免疫系统受损、淋巴细胞显著减少等特征性表现，骨髓、肺脏、肝脏是急性感染后病毒复制的二级场所。

de Carvalho Ferreira等为了研究持续性感染 ASFV的宿主动物的排毒动态，采用 3种毒株来分析宿主动物染毒70 d后的排毒情况，结果表明，病毒剂量、感染途径不影响病毒的排泄，鼻、眼和阴道分泌物中的ASFV滴度最低，口咽拭子中始终存在病毒，而粪便中偶尔出现高效价病毒，这丰富了ASF的传播和流行病学的相关研究。Sánchez-Cordón等采用不同剂量和免疫途径（肌内和鼻内途径）对猪免疫接种低毒性的OURT88/3毒株，结果发现鼻内接种低剂量和中剂量（103和104TCID50）可以达到100%的保护，受保护的猪仅出现轻微和短暂的临床反应，在攻击后的血液样品中检测到瞬时的病毒基因组；相比之下，用低剂量和中等剂量的肌内免疫猪表现出较低的保护率（50%～66%），且在整个血液样品中几乎检测不到病毒基因组。Post等通过不同年龄和不同感染剂量的ASFV（即12周龄/低病毒剂量、12周龄/高病毒剂量、18周龄/低病毒剂量、18周龄/高病毒剂量）来研究 ASFV对猪血液参数的影响，发现中等剂量感染组的存活率为 30%，存活率较高的多为年龄较老的猪；还发现在感染3～5 d后，许多不同类型的细胞减少并伴有体温升高，这表明γσT细胞和IL-10水平可能与猪感染ASFV而出现死亡有一定联系，上述研究结果为ASF的防控提供了一定的理论依据。2007年格鲁吉亚出现大范围的ASF疫情，随后在2007—2012年间，大量家猪和野猪感染ASFV，研究发现该病毒的循环模式也许是其一直保持高致病性的重要原因。2013年，de Carvalho Ferreira首次采用参数建模的方式对 ASFV在空气中的传播情况进行研究，发现在急性ASF中，带毒猪可将病毒排泄到空气中。为了揭示感染宿主反应的抑制或调节相关的基因的遗传变异性，Frączyk等将时空分析与67个野外ASFV分离株的系统发育研究相结合，指出与宿主免疫系统的逃避相关的基因内的遗传变异性可用于追踪 ASFV分子进化方向。Carlson等开发了一个动物模型试图关联宿主免疫应答，在Pret4Δ9GL感染动物后，对不同时间的ASFV抗体水平，ASFV特异性干扰素 γ（IFN-γ）应答和循环细胞因子的存在进行评估。此外，病毒在感染过程中诱导一些细胞因子的释放，如 ASFV激活肺泡巨噬细胞释放IL-1、TNF-α及氧自由基等，IL-1和TNF-α作为中性粒细胞的趋化因子，导致中性粒细胞的聚集，这在急性ASF传播方面发挥一定作用，同时导致微血栓形成和内皮细胞受损，释放的氧化自由基致使脏器出血和弥散性血管内凝血。

ASFV与不同宿主间的相互作用决定了病毒对不同宿主的致病性存在差异。对于家猪而言，不同毒株对家猪的致病力表现出不同，机体感染病毒后，出现急性死亡到亚临床感染等不同的临床症状对于野猪而言，其与家猪表现出不同的特征，野猪感染ASFV后常表现为无明显症状且仅伴有低病毒血症，在流行地区，大多数的成年野猪血清表现出ASFV阳性，并持续感染，但排毒量较低甚至不排毒对于蜱而言，其主要是通过吸食带毒猪血液而感染ASFV，蜱的肠上皮细胞中的吞噬细胞为病毒的初始复制场所，随后，病毒复制出现于未分化的肠细胞中，2～3周后，病毒扩散到其他组织。研究发现，易感蜱在饱血4周后，其体内就出现病毒复制，且保持较高的病毒滴度，通过叮咬又可将病毒从蜱体内传播到易感猪体内。

2.2 ASFV与宿主细胞的相互作用

2.2.1 病毒的吸附ASFV感染的主要靶细胞是猪单核-巨噬细胞，因此，单核-巨噬细胞是最先检测到病毒的地方，随后在树突状细胞、内皮细胞、巨核细胞、血小板、中性粒细胞和肝细胞也可检测到ASFV。研究发现，ASFV易感细胞表面存在很多病毒结合位点，病毒的入侵过程需要细胞表面受体介导，其中细胞脂质胆固醇参与了ASFV的感染过程。Franzoni等发现在ASFV感染和未感染的细胞中，CD163的表达未出现明显差异，下调CD163的表达未改变单核细胞和巨噬细胞亚群中的MHCⅡ的水平；与模拟感染的对照相比，BA71V感染未活化的（moMF）和活化的（moM2）单核细胞衍生的巨噬细胞中MHCⅠ的表达降低，上述结果表明在抵抗激活的巨噬细胞反应进化机制方面，ASFV毒株之间存在差异，其中有毒的分离毒株已进化了防御机制，从而促进了 ASFV的生存能力。使用CD163抗体作用巨噬细胞可抑制 ASFV的感染，这表明巨噬细胞表面的CD163受体与细胞对 ASFV的易感性密切相关，但CD163受体是否是介导ASFV感染的受体还需进一步验证。Popescu等在完全敲除CD163的猪巨噬细胞上接种Georgia2007/1毒株，发现敲除的和野生型猪都变得易感，然而在临床体征、死亡率、病理学或病毒血症方面没有出现明显差异，且在巨噬细胞的体外感染方面也没有出现差异，这表明对于感染Georgia2007/1毒株而言，CD163不是必需的，但不排除其他 ASFV毒株对CD163的依赖性。

此外，病毒编码的许多蛋白也参与细胞表面受体的结合过程，如在体外试验中，P54和P72中和抗体可阻断ASFV与巨噬细胞的结合，这也表明 P54和 P72蛋白在病毒的吸附过程中发挥一定作用。ASFV通过动力素依赖性和网格蛋白介导的内吞机制进入天然宿主细胞，利用其囊膜和内吞泡膜的融合机制将病毒释放到细胞浆之中，研究者发现依赖于肌动蛋白的内吞作用和具有活性的磷酸肌醇 3-激酶（PI3K）的参与在病毒的入侵过程中有重要作用。Bruno等和André s将流式细胞术与药物抑制剂相结合，采用荧光和电子显微镜方法，解释了 ASFV感染其天然宿主细胞—巨噬细胞的感染通路，发现纯化的胞外 ASFV被成型的巨噬细胞所吞噬，以及被网格蛋白介导的内吞作用所内化的过程；一旦进入细胞内，ASFV颗粒从早期的内涵体移动到晚期的大囊泡体，并完成脱壳，释放出具有复制能力的基因组，其中内膜蛋白pE248R对膜融合和衣壳核的递送起着重要作用；同时还发现病毒脱壳需要酸性环境，且该过程涉及到病毒外膜和蛋白质衣壳的破坏。

2.2.2 病毒基因复制与表达ASFV进入细胞后，病毒核心被转运到细胞核周围，首先利用包装在病毒粒子内部的酶和蛋白因子进行早期mRNA的转录和翻译，为病毒复制提供所需的DNA聚合酶等材料，在感染6 h后，ASFV开始在细胞浆中进行复制，其复制方式与痘病毒十分相似。在ASFV感染3～4 h后，病毒DNA复制在细胞核中启动，产生小的复制型中间体，随后转移到细胞质，形成大的中间体，并在细胞质的“病毒工厂”中成熟。基因转录与DNA复制的协调运行对ASFV基因的表达有调控作用，细胞质中病毒的DNA开始复制后，病毒基因的转录模式就发生转变，这种转录机制让 ASFV拥有一定的独立性，使病毒基因的表达变得准确可控。在ASFV体外感染的早期阶段，Freitas等对具有抗病毒活性的氟喹诺酮类药物进行筛选，发现细菌拓扑异构酶抑制剂可通过ASFV拓扑异构酶Ⅱ来干扰病毒的复制，为相关药物潜在靶标的筛选和ASF疫苗的开发提供了新的思路。在ASFV感染的早期阶段就可检测到病毒蛋白的表达，其中在DNA复制起始时，病毒晚期蛋白的表达也随之开始，编码蛋白在翻译后需经过修饰作用，进而影响蛋白的定位、稳定性和生物功能。

2.2.3 病毒粒子的组装ASFV的感染过程涉及波形蛋白的重排，依赖于微管的波形蛋白在病毒装配位点聚集成星状，然后定位到微管组织中心附近，当病毒DNA开始复制时，星状结构变成笼状结构，可阻碍病毒成分被转移到细胞质中，且可将病毒晚期结构蛋白聚集到病毒装配位点。ASFV病毒粒子的形成发生于细胞核周围的“病毒加工厂”区域，其中 P54蛋白在病毒感染过程中，尤其在病毒蛋白经内质网膜转化成病毒包膜前体时发挥着非常重要的作用。P54蛋白含有一个LC8动力蛋白结合结构域，可与8 ku的轻链细胞质动力蛋白DLC8发生交叉反应，并在病毒内化及将病毒运输到复制区的过程中起重要作用。在病毒粒子形成的最初阶段，P72结构蛋白从细胞质中富集并与内质网膜结合，然后在膜凸起的表面上形成衣壳，在凹进的表面上形成衣壳心。在病毒装配阶段，首先被病毒蛋白修饰后的内质网膜作为病毒粒子内膜，随后P72蛋白被装配到病毒粒子之中，同时多聚蛋白P220被酰基化后连接到未成熟的病毒粒子衣壳内膜，接着病毒晚期结构蛋白P49得到表达，形成二十面体病毒粒子，下一步是多聚蛋白P220和P62经S273R酶分解加工为P150、P37、P34、P14、P35和 P15蛋白，这6种结构蛋白位于成熟的病毒粒子的核衣壳之中，形成病毒核衣壳和有感染性的病毒粒子，最后病毒粒子二十面体闭合，病毒DNA嵌入及核心蛋白浓缩，最终形成成熟的病毒粒子。研究发现P220和P62的正常加工是病毒粒子成熟的一个重要指标。Hakobyan等研究了5种具有抗病毒活性的类黄酮对ASFV在Vero细胞中的复制的影响，发现有效剂量的芹菜素具有抗ASFV活性，进一步试验结果表明芹菜素在ASFV感染的早期阶段具有高效的作用，该类黄酮可抑制 ASFV特异性蛋白质的合成和病毒工厂的形成。

2.2.4 病毒的释放成熟的病毒粒子在“病毒加工厂”形成后，沿着微管排列，依靠微管蛋白系统中常规驱动蛋白将病毒粒子转运到细胞膜，并通过出芽的方式从细胞中释放出来。研究发现，P54蛋白和PE120R蛋白参与了病毒粒子从装配位点到细胞膜的运输过程。具有感染性的成熟病毒粒子在被释放到胞外后，在病毒粒子表面将形成一层囊膜，该囊膜与ASFV的感染性无关，可能参与病毒对宿主细胞的吸附作用。此外，病毒CD2v蛋白参与胞外病毒粒子与红细胞的结合，且可能在病毒的出芽过程中发挥一定作用。

目前，有关 ASFV与宿主相互作用的研究得到了快速发展，但关于病毒逃逸宿主免疫防御的具体机制，以及宿主的抗感染免疫机制还不是十分清晰，或许会成为ASFV研究的重点。

3 小结

ASF作为一种重要的动物疫病，其病原结构和流行病学复杂。虽然中国尚未出现ASF疫情，但随着经济的快速增长，中国与世界各国的贸易往来日益频繁，这就增大了中国暴发ASF的风险，且ASF具有传染性强、死亡率高、缺少有效的疫苗等特征，中国周边地区已相继出现该疫情，目前关于ASFV的分子病原学和致病机理的中文文献资料的报道较少。因此，开展对ASF的相关研究，尤其对该病毒的分子病原学和致病机理的深入研究尤为重要。

（摘自《中国畜牧兽医》2017年第7期）