非洲猪瘟病毒实验室诊断方法的研究进展

林彦星 曹琛福 杨俊兴 阮周曦 吴江 吕建强 花群义

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASF virus，ASFV）感染引起的猪的一种急性、烈性、高度传染性疾病，以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征。世界动物卫生组织（OIE）将 ASF列为法定报告疫病，我国将其列为一类动物疫病。ASFV是非洲猪瘟病毒科（Asfarviridae）非洲猪瘟病毒属（Asfivirus）的唯一成员，是一种具有二十面体形态的有包膜的双链DNA病毒，平均直径为200 nm。不同分离株的基因组长度在170～190 kb之间变化，具有共价的闭合末端、反转重复区和发夹结构。ASF最早发生于肯尼亚，随后逐渐在非洲、美洲和欧洲的多个国家流行，近10年来，全球已有41个国家报告发生ASF疫情。俄罗斯自ASF传入以来，养猪业遭受了重大损失，我国与俄罗斯接壤边界线长达4370 km，边境地区情况复杂，有野猪和生物媒介软蜱分布，疫情极易跨境传播。从2014年1月至2017年 7月，俄罗斯伏尔加格勒州等 31个地区发生 166起野猪和 304起家猪 ASF疫情，898头野猪和 10393头家猪感染2017年3份，俄罗斯伊尔库兹克州发生ASF疫情，疫点距我国满洲里口岸不足1000 km，ASF跨境传入我国的风险逐步增加。由于目前没有有效的治疗方法或疫苗来预防 ASF，一旦发生疫情很难根除和净化，只能通过执行严格的卫生防疫措施，扑杀染疫动物控制疫情蔓延；对于非ASF疫区国家来说，建立快速有效的检测方法对防止该病传入具有重要意义。现就ASFV实验室诊断方法进行综述，以期为我国 ASF诊断方法研究提供技术参考。

1 病原鉴定

1.1 血球吸附 （haemadsorption，HAD）试验

HAD试验是基于猪的红细胞能够吸附在感染 ASFV单核细胞或巨噬细胞表面，在出现细胞病变（cytopathic effect，CPE）之前形成特征性的玫瑰花环状，绝大多数从非洲分离的 ASFV毒株以及最初从欧洲国家分离的 ASFV毒株均产生猪红细胞吸附现象。1963年，TUBIASH等在西班牙首次发现了不能吸附红细胞的ASFV，这些毒株能在白细胞培养物内产生细胞病变，但没有红细胞吸附能力；因此对HAD试验阴性结果应通过PCR和/或FAT来确认以避免出现假阴性结果。由于HAD试验过程至少需要7～10 d，且对实验室要求较高，通常只有参考实验室采用该方法。

1.2 荧光抗体试验（fluorescent antibodytest，FAT）

FAT可以用作ASFV抗原检测的一种辅助方法，该法利用标记了异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocanate，FITC）的抗 ASFV特异性抗体能够与猪感染组织（尤其是脾脏、肺、肾和淋巴结）涂片中的ASFV抗原相结合，通过抗体发出的荧光判断样品中是否有抗原存在。FAT可用于田间疑似感染猪或实验室接种猪组织的 ASFV抗原检测，也可以用于鉴定无红细胞吸附能力的毒株，还可用于区分ASFV和其他病毒（如伪狂犬病病毒）或细胞毒性接种物产生的CPE。但对于亚急性或慢性型ASF，FAT敏感性明显下降，容易出现假阴性结果，这可能与感染组织中形成的抗原抗体复合物阻断ASFV抗原和ASF标记物之间的相互作用有关。

1.3 双抗体夹心 ELISA/抗原捕获ELISA

VIDAL等以抗ASFVVP73蛋白的特异性单克隆抗体为基础建立了夹心ELISA方法，该方法利用包被于酶标板上的单克隆抗体捕捉ASF病毒粒子，再通过酶标抗体与病毒进一步结合，最后显色判定样品中是否存在 ASFV抗原，最低可以检测 VP73抗原质量浓度为0.05 mg/L，2.3×102PFU/mL全病毒颗粒。HUTCHINGS等建立了 2种间接的夹心ELISA法检测ASFV抗原，一种使用的是针对细胞质中可溶性病毒蛋白产生的多克隆抗血清，第二种是抗VP73蛋白和多克隆血清的单克隆抗体的组合，结果表明利用多克隆抗血清比使用单克隆抗体稍微敏感些。AFAYOA等将纯化的病毒 VP73蛋白免疫家兔制备多克隆抗体用于夹心 ELISA的抗原捕获，ELISA的诊断灵敏度为82.95%（95%CI，78%～100%），诊断特异性为96.59%（95%CI，90%～100%）。

1.4 测流分析（lateral flow assay，LFA）

SASTRE等利用抗VP72蛋白的单克隆抗体作为检测线捕获试剂，抗血清蛋白 IgG单克隆抗体作对照线捕获试剂制备了用于检测血液中ASFV的试纸条，并与商品化抗原ELISA和PCR进行比较。对于试验感染样品，LFA跟ELISA有很好的相关性，LFA对动物循环病毒水平超过104HAU是有效的，PCR则更为敏感；对于田间样品，PCR同样可以检出更多阳性样品，LFA检出的阳性样品数则超过ELISA。

1.5 病毒基因组检测

1.5.1 酶链式反应（polymerase chain reacion，PCR）目前，使用最广泛的ASFV检测技术是PCR，即根据 ASFV基因组高度保守区域设计特异性引物进行PCR扩增检测ASFV核酸。OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册提供了几种PCR方案。这些方案包括用于区分ASF和CSF的多重PCR和实时PCR。PCR技术的广泛传播及其适用性广使其成为世界各地实验室的常规方法，近年来研究人员建立了多种PCR法检测ASFV。

TIGNON等根据P72基因保守区域设计引物探针，建立了同时检测内参基因猪β-肌动蛋白和ASFV的多重实时荧光PCR，该方法已被4个欧盟ASF国家参考实验室验证。RONISH等建立一种基于线性指数PCR （linear-after-the-exponential PCR，LATE-PCR）检测ASFVVP72基因的方法，LATE-PCR是不对称PCR，该法直接扩增大量的单链DNA，在终点读取荧光值，通过溶解曲线分析验证靶基因的扩增，检测限达到几个拷贝，为实验室和田间ASF诊断提供一种新方法。HAINES等建立了检测ASFV、CSFV和外源内控RNA的三重实时荧光PCR，提取核酸前将外源内控RNA添加到样品中，作为核酸提取和 PCR扩增控制，可识别假阴性结果，该法的检测最低限为22个ASFV基因组拷贝和5个CSFV基因组拷贝；对ASFV、CSFV的诊断灵敏度均为100%，特异性分别为 97.3%和100.0%。 FERNANDEZ-PINERO 等使用商品化通用探针库（universal probe library，UPL）探针与设计的特异性引物对组合来扩增VP72基因中的DNA片段，该法检测限小于18DNA拷贝，且比OIE手册推荐的TaqMan实时荧光PCR更为灵敏。

WOZNIAKOWSKI等利用一种新型的聚合酶交叉螺旋反应（polymerase cross-linkings piral reaction，PCLSR）技术检测猪血中ASFVDNA，PCLSR使用 3条引物进行扩增，2条外螺旋引物包括ASFVP72基因 3′ 端互补序列和黑寡妇α-内毒素外源基因5′ 端反向互补序列，另外一条交联引物为ASFVP72基因特异性引物，该方法对含有P72基因的质粒灵敏度达到7.2×102拷贝/μL。LUO 等基于 GenBank中所有可用的ASFVVP73基因序列高度保守区域设计了特异性引物，建立了改进的PCR方法，该法比2种经 OIE确认的 PCR法更敏感，对62份猪血检测结果与 UPL实时荧光PCR法一致。FRACZYK等首次建立了交叉引物扩增方法（crosspriming amplification method，CPA）检测猪血液和血清中ASFVDNA，该法与UPL实时荧光PCR法具有相同的灵敏度，对含有P72基因的标准质粒灵敏度达7.2拷贝。

我国研究人员也先后建立了ASFV普通PCR法和实时荧光PCR法，均具有良好的敏感性和特异性，可用于ASFV核酸检测。崔尚金等将纳米金颗粒作为热导介质建立了ASFV高效纳米PCR检测方法，敏感性是常规PCR的1000倍，最低可检出10个拷贝核酸。

1.5.2 重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）RPA是一项由重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶等参与，在等温条件下进行核酸扩增的新技术。实时荧光RPA法结合一个便携式的等温扩增仪可在15 min内获得检测结果，检测时间和便利性优于传统PCR法。王建昌等建立了一种ASFV RPA等温检测方法，38℃水浴恒温反应 30 min实现对目的片段的有效扩增，对含ASFVVP72基因质粒的扩增，方法检测限与OIE推荐的实时荧光PCR法一致。

1.5.3 环介导等温扩增技术（loop amplification assays，LAMPs）LAMPs与传统PCR相比，操作简单、快速灵敏，无需特殊仪器。JAMES等针对 ASFV 拓扑异构酶 Ⅱ 基因建立了一步法检测ASFV的LAMPs方法，最低可以检测到 330拷贝DNA的病毒。ATUHAIRE等比较了LAMPs法跟OIE推荐的PCR法的灵敏度和特异性，结果显示 LAMPs法对田间样品中ASFV DNA检测灵敏度高于PCR法。国内学者均根据ASFVP72基因建立了ASF LAMPs检测方法，特异性良好，与常规PCR比灵敏度高，可用于ASF快速检测。

1.5.4 原位杂交 （in situ hybridization，ISH）ISH是将标记的核酸探针与组织细胞中的待检测核酸特异结合，再用检测系统检测标记探针，同时显示核酸所在的位置。BALLESTER等使用 ISH技术，用地高辛标记的探针检测福尔马林固定、石蜡包埋组织中的ASFVDNA，并取得较好的检测效果。

2 抗体检测

由于目前仍无有效的疫苗能够用于预防 ASF，不存在疫苗抗体干扰的问题，而感染 ASFV强毒的猪在产生抗体前已经死亡，因此检测到 ASFV抗体则表明可能存在低毒力或中等毒力ASFV感染。

2.1 酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA是ASF血清学研究中最常用的方法，可检测血清和组织液，适用于大量样品的筛查，是国际贸易指定的检测方法。近年来研究人员利用原核/真核表达的蛋白作为检测抗原建立了多种ELISA方法。GALLARDO等利用原核表达的4种重组融合蛋白作为抗原，其中基于重组蛋白p54、pB602L和pK205R的 ELISA方法敏感性和特异性与OIE推荐的方法相当，可用于保存不当的血清ASFV抗体的检测。曹琛福等用原核表达纯化的 P54蛋白建立的间接 ELISA法可检测到 1∶1280稀释样品，而靳雯雯等用原核表达的 VP73蛋白建立的间接 ELISA方法检测灵敏度可以达到1∶2560，与进口试剂盒相当。GIMENEZLIROLA等利用原核表达的重组蛋白p30建立的双矩阵间接ELISA方法，可用于检测血清和口腔液样本中ASFV抗体。

SAKAMOTO等在昆虫细胞中表达蛋白P32和P54作为检测抗原，试验结果显示，在免疫印迹中，P54在感染早期的抗体检测中敏感性比P32更高，而P32在间接ELISA中表现出更好的反应性。董志珍等利用单克隆抗体建立的竞争ELISA方法灵敏度高于间接免疫荧光法，可用于猪血清的 ASFV抗体检测。曾少灵等和梁云浩等分别用杆状病毒表达系统表达VP73、P54蛋白作为间接ELISA检测抗原，均具有很好的特异性。NIETO-PELEQRIN等分别用半纯化的ASFV VP72蛋白和人胚胎肾细胞（HEK 293T）表达的重组ASFV VP30蛋白作为间接ELISA检测抗原，首次在接种猪粪便样本中检测到AFSV抗体，这2种ELISA方法对现场条件下ASF监测可能非常有用。

2.2 间接荧光抗体试验（indirect fluorescent antibodytest，IFA）

IFA可用于检测感染 ASFV猪的血清样品。将感染ASFV猪的肾细胞或猴细胞固定到载玻片上，使被检血清与载玻片上的抗原结合，将已结合的抗体与荧光素标记的猪免疫球蛋白抗体结合，然后在荧光显微镜下观察结果。IFA适用于无ASF流行地区ELISA检测阳性的血清以及来自地方性流行的地区经 ELISA检测无法确定结果的血清确证试验。

2.3 免疫印迹检测（immunoblotting test）

免疫印迹是将蛋白质电泳技术与血清学相结合的一种免疫生化技术，ASFV感染细胞浆中可溶性病毒蛋白经丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至硝酸纤维素膜上，再与待检血清样品反应，加入酶标二抗，洗膜后加入底物显色，通过与阳性对照比对（条带形状、颜色强度等）判定试验结果。该方法特异性高，能简单客观的判定结果，能识别出弱阳性结果，可作为IFA替代方案对个别不确定结果进行确证。

2.4 胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析技术是近年来发展迅速的一项检测技术，操作简便、特异灵敏，可直接观察结果，适合基层现场检测。张鑫宇等原核表达 P54重组蛋白，用胶体金标记后喷涂纤维垫，并分别以SPA和抗P54多克隆抗体作为检测线和质控线，制作ASF VP54抗体检测胶体金免疫层析试纸，具有特异性强、敏感性高等特点。

3 展望

近年来，随着世界经济全球化的发展以及自然生态环境的改变，一些严重危害人类和动物健康的疫病（如亚洲Ⅰ型口蹄疫、小反刍兽疫）已传入我国，严重影响我国现代农业、养殖产业的发展。当前ASF传入我国的风险不容忽视，一旦传入将会给我国的养殖业造成巨大损失。因此，对该病实验室诊断技术的研究储备对防止该病传入和传播至关重要。

研究人员已经开发出多种 ASF实验室诊断方法，以便在现场条件下进行早期诊断。对于病原检测，普通PCR、荧光PCR等病毒基因组检测方法在ASFV早期诊断中发挥重要作用；并已开发出简单快速的技术，包括RPA、LAMPs等，这些快速检测方法有助于官方尽早采取控制措施，从而减少疫病传播的负面影响。血清学检测方面，由于不存在疫苗抗体干扰的问题，通常检测到ASFV抗体则表明可能存在低毒力或中等毒力ASFV感染，因此，血清学检测对非ASF疫区国家的进口检疫监测具有重要的意义，建立快速、敏感、特异的ASFV抗体快速检测方法已成为越来越多研究者研究的重点。

（摘自《中国兽医学报》2018年第10期）