非洲猪瘟病毒感染机制和诊断方法的研究进展

李洪利 张维 李慧 王君玮 曹金山

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由属于非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的猪的一种急性、高度接触性传染病。强病毒株感染家猪的发病率和死亡率达100%，曾在非洲、美洲和欧洲部分地区广泛流行，并造成了严重的经济损失。目前，该病在非洲的东部和南部地区、俄罗斯的北高加索地区仍时有发生。由于对养猪业危害很大，而且无有效的疫苗用于预防，世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定呈报的动物疫病，我国规定其为一类动物传染病。

ASFV颗粒有囊膜，呈二十面体对称。基因组由单分子线状双股DNA组成，长度为170～190 kb之间，含有共价的闭合末端、反转重复区和发夹结构，编码许多与病毒复制有关的酶和对病毒生存传播具有重要作用的蛋白。

ASFV主要以猪的巨噬细胞为感染靶细胞，病毒通过受体介导的胞吞机制侵入靶细胞，利用其囊膜与内吞泡膜的融合机制将病毒释放到细胞质，然后，病毒核衣壳被转移到宿主细胞核周围，先利用包装在病毒粒子内的酶和细胞因子进行mRNA的转录，以提供病毒复制所需的DNA聚合酶等。在感染6 h后，病毒开始在细胞质中复制，病毒早期基因表达转向晚期基因表达。然后，在细胞质的病毒工厂进行病毒装配，形成完整的病毒粒子，装配好的病毒粒子转移到细胞膜，经细胞膜出芽释放。

1 ASFV感染机制的研究

1.1 病毒对宿主细胞的侵入机制ASFV

利用受体介导的胞吞作用和感染细胞的结合位点进入宿主细胞。细胞表面的特异性识别受体是决定宿主类别和病毒组织侵染性的关键因素。病毒编码的许多蛋白参与病毒与细胞表面受体结合及病毒侵入宿主细胞的过程。宿主细胞膜具有与病毒p12蛋白的结合位点，病毒的感染力依赖于p12蛋白与细胞受体的结合。到目前为止，p12是唯一竞争性的与靶细胞结合的蛋白。蛋白pE248R是嵌膜蛋白，位于成熟病毒粒子的内膜，对病毒早期侵入宿主细胞至关重要。

ASFV感染宿主细胞后，机体会产生抗体中和病毒，抑制病毒的附着及胞吞入宿主细胞，抗体可以结合结构蛋白 p30、p54、p72，p54、p72蛋白的抗体可以抑制病毒复制循环期的病毒附着，而 p30抗体可以抑制病毒感染靶细胞。

此外，ASFV感染靶细胞还依赖于内吞体的酸化作用和动力蛋白GTP酶活性。ASFV通过网格蛋白介导的胞吞作用进入宿主细胞，网格蛋白介导的胞吞作用需要动力蛋白GTP酶激活。在ASFV感染过程中，网格蛋白介导的胞吞作用及其主要成分EPs-15起着重要的作用。

1.2 ASFV侵入宿主细胞后的DNA复制机制

ASFV DNA的复制开始于宿主细胞的细胞核复制时期，然后是细胞质复制时期，所以病毒的核质转运在病毒的复制循环过程中起重要作用。蛋白p37在ASFV复制过程中介导病毒DNA的核质转运，在感染早期，蛋白p37伴随病毒DNA进入并聚集于细胞核，病毒DNA在宿主细胞核复制后，蛋白 p37和病毒DNA一起转运到细胞质，然后聚集于细胞质的病毒工厂中。

当ASFV感染猪体时，机体会启动免疫反应，被感染的细胞激活自杀程序，ASFV通过抑制细胞凋亡使病毒在宿主细胞内进行复制。A179L基因编码的蛋白与bcl-2作用相似，可在ASFV感染时期调节宿主细胞凋亡，在感染早期阻止细胞凋亡，使病毒在宿主细胞内大量复制，对病毒持续性感染起着重要作用。A224L基因编码的蛋白可抑制半胱天冬酶活性来提高细胞的存活。此外，MGF360和MGF530基因也可以提高感染细胞的存活率，对ASFV在宿主细胞中的复制起重要作用。

ASFV通过两种系统来维持病毒基因组的完整。一种是DNA前体合成所需要的酶系统，如核苷酸还原酶、胸苷激酶、胸苷酸激酶等；另一种是碱基切除修复系统，可以修复水解或氧化造成的病毒DNA的碱基损伤。病毒DNA聚合酶X是分布广泛的聚合酶，虽然缺乏校对3'～5'核酸内切酶活性，但在病毒感染时，DNA聚合酶X参与了病毒的碱基切除修复。ASFV蛋白pE296R是Ⅱ 类AP核酸内切酶，对AP位点具有特异性核酸内切活性并具有校对3'～5'核酸内切酶活性，能够有效地切除错配，在病毒感染后期，AP核酸内切酶在感染细胞的病毒工厂中，参与后期的病毒碱基切除修复过程。ASFV利用DNA聚合酶X、连接酶和 AP核酸内切酶组成了病毒切除修复系统来保证病毒基因复制的精确性。

ASFV编码的蛋白pE165R属于dUTP酶家族，可减少dUTP含量，并提供胸苷酸激酶底物来保证病毒DNA的完整性。在自然感染条件下，dUTP酶可以降低dUTP的浓度，进而降低dUTP错配入病毒DNA的可能性，以保证基因复制的精确性。

1.3 参与 ASFV装配过程的蛋白及装配机制

ASFV在宿主细胞质核周的病毒工厂进行装配，装配部位集中在微管形成中心和高尔基复合体。在病毒工厂中ASFV的装配开始于前体膜结构的形成，内质网源性病毒膜是内层病毒被膜前体。被膜前体经外衣壳的逐步装配形成二十面体结构。多聚蛋白pp220和pp62的蛋白酶解加工是与装配有关的重要的成熟过程。跨膜结构蛋白 p54对内质网膜的募集和转化为病毒被膜前体至关重要，在病毒装配位点，p54的表达可以影响病毒多蛋白类的正常定位，抑制 p54的表达会中断内质网膜向病毒装配位点内部的转移，进而阻碍内质网膜转化成被膜前体及病毒颗粒的形成。

多聚蛋白pp220和pp62的蛋白酶解加工是ASFV核装配过程的关键步骤。在病毒感染过程中，这两种蛋白被蛋白水解酶逐步加工，产生6种主要的结构蛋白，蛋白p150、p37、p34、p14来源于pp220，蛋白p35、p15来源于pp62。两种多聚蛋白的成熟产物是组成核壳的基本组件，约占病毒粒子蛋白总量的30%。ASFV蛋白水解酶pS273R可催化多聚蛋白前体的蛋白酶解加工，并参与病毒感染后期的成熟过程，对病毒的核装配起重要的作用。p17在病毒膜前体转化为二十面体结构中间体的过程中起重要的作用，p17是内膜蛋白，位于病毒包膜前体及胞内成熟病毒颗粒，p17的表达对多蛋白pp220和pp62的酶解加工至关重要，p17表达的抑制导致膜前体的积累和衣壳及核壳主要成分的离域，阻碍病毒前体膜的成熟，影响病毒在病毒工厂前体膜阶段的形态学变化。非结构蛋白pB602L在ASFV感染的后期表达，是衣壳蛋白 p72正确折叠的伴侣蛋白。抑制pB602L合成可影响病毒多聚蛋白 pp220和 pp62的蛋白酶解加工，并且导致p72蛋白的减少和衣壳蛋白pE120R的离域，pB602L对病毒粒子二十面体结构的形成起着重要的作用。

1.4 成熟病毒粒子向胞外的运输释放机制

病毒转运最普遍的方式是在宿主细胞内的病毒成分利用微管进行直接的大范围转运。经过装配以后，成熟的ASFV颗粒离开病毒工厂，经细胞质，然后由宿主细胞释放。装配的 ASFV从装配部位到细胞表面的运输依赖于微管和驱动蛋白。ASFV感染可提高微管的稳定性，在病毒复制的早期，ASFV利用微管向核周区域进行分子运输。驱动蛋白为胞内物质（如线粒体、溶酶体、内质网、mRNA）的转运提供动力，并利用微管把病毒从核周装配部位转移到质膜。ASFV颗粒的运输主要通过蛋白p54和动力蛋白LC8轻链的直接结合来控制微管动力复合物的胞内运输。病毒的结构蛋白同小分子动力蛋白复合物的直接结合可以形成微管介导的病毒运输的分子机制。此外，蛋白pE102R对胞内病毒从装配部位向质膜的运输起重要作用。

1.5 ASFV逃避宿主免疫防御机制的蛋白及其作用机制

ASFV利用非常有效的机制逃避宿主的免疫防御系统。细胞因子类是炎性介导和免疫反应的重要调节物质，可以刺激炎性反应对抗病毒感染。ASFV可以抑制感染的巨噬细胞中IFN-α和 TNF-α的分泌及致炎细胞因子类的产生。

ASFV利用A238L基因编码蛋白阻碍NFκB激活的机制抑制促炎症反应和抗病毒细胞因子的产生。A238L基因编码蛋白与 IκB有相似的锚蛋白重复序列，与宿主的NFκB结合使NFκB处于非活化状态，导致NFκB不能与靶DNA结合，减少致炎细胞因子产生量。A238L基因编码蛋白还可以通过抑制钙神经素磷酸酶的活性，使钙神经素依赖性通道和 NFAT转化因子的活性受到抑制。

巨噬细胞是 TNF-α的主要来源，TNF-α是抑制病毒感染的多效性细胞因子，TNF-α转录可以被几种转录因子如NFκB、NFAT和c-Jun调节。转录辅助激活因子的过量表达可恢复TNF-α启动子的活性。A238L基因编码蛋白通过抑制NFκB、NFAT和 c-Jun的表达抑制TNF-α的活性。A238L基因编码蛋白抑制TNF-α表达是ASFV逃避宿主免疫反应的有效机制。

此外，感染细胞的凋亡也是机体免疫防御的重要组成部分。ASFV某些基因通过调节宿主细胞凋亡使病毒逃避免疫防御，如A179L基因和与A224L基因编码的蛋白可以调节程序性的细胞死亡或干扰宿主细胞反应。

2 ASFV检测方法的研究

由于ASF无有效的疫苗用于防控，因此敏感、特异、快速的ASFV实验室检测对ASF的防控和根除措施的实施至关重要。目前，用于检测 ASFV的方法主要有ELISA、病毒核酸检测、免疫印迹（IB）、红细胞吸附试验（HD）、直接免疫荧光实验（DIF）、间接免疫荧光（IFA）等方法。OIE推荐检测 ASFV的方法有PCR、实时荧光定量PCR、ELISA和IB。其中，病毒核酸检测和ELISA操作简单，可以快速敏感的检测ASF，是监测 ASF传播流行首选的两种方法。

2.1 病毒核酸检测

King等针对ASFV VP72基因建立了TaqMan荧光定量PCR检测可以用于鉴别诊断ASF、典型猪瘟（CSF）和猪皮炎肾病综合症（PDNS）。Zsak等建立的检测 ASFV实时荧光定量PCR方法，该方法检测组织样品的敏感性高于血液样品，因此可以用于检测 ASFV感染的组织样品。Basto等建立了检测蜱ASFV的套式PCR方法，该方法采用内参对照，敏感性高于OIE推荐的PCR检测方法，可以用来检测蜱是否携带ASFV。Giammarioli等建立了检测CSFV、ASFV、2型猪圆环病毒（PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）5种病毒的多重PCR检测方法，检测ASFV的单重PCR方法的敏感性高于多重PCR方法，可以用于这 5种病毒感染的鉴别诊断。

Tignon等针对 VP72基因设计引物探针，建立了检测 ASFV的实时荧光定量PCR方法，采用内部参照，检测限为5.7～57拷贝的ASFV基因组 DNA，该方法敏感性高于OIE推荐的常规PCR和实时荧光定量PCR方法。MGB探针实时荧光定量PCR方法是快速、灵敏和特异的检测 ASFV的方法，McKillen等根据9GL基因建立了MGB实时荧光定量 PCR检测方法，最低可以检测到20拷贝标准DNA。该方法检测临床样品中的 ASFV，敏感性与 OIE推荐TaqMan荧光定量PCR方法相当，检测范围为2×101～2×1010拷贝。

Ronish等基于ASFVVP72基因建立了线性指数聚合酶链式反应（linear-after-the-exponential PCR，LATE-PCR）检测方法，LATE-PCR是不对称PCR的一种形式，该方法可以大量扩增单股目的片段，在PCR扩增的终点进行荧光读数，通过溶解曲线分析目的片段的扩增，可以用于检测组织样品的病毒，其敏感性可以达到大约1拷贝的病毒DNA，为 ASFV的实验室诊断提供了敏感的检测方法。

环介导等温扩增（LAMP）技术检测速度、敏感性、特异性均优于PCR技术，并且检测成本远低于荧光定量PCR，针对拓扑异构酶Ⅱ基因建立的检测ASFV的LAMP方法，最低可以检测到330拷贝DNA的病毒，并可以用于ASFV的检测。该方法与实时荧光定量PCR检测血液和组织样品的结果一致。在ASF流行地区，该方法为ASF的诊断提供了特异、实用、经济、快速的分子检测模式。

2.2 ELISA检测方法

Pastor等用细胞质可溶性抗原CS-P，建立了斑点免疫检测方法（DIA），敏感性与 OIE推荐的ELISA和IB方法相当，检测150个阳性样品，ELISA检测92%为阳性，IB检测98%为阳性，DIA检测96%为阳性，其最大的优势是检测快速。利用VP73单克隆抗体，建立的检测样品中ASFV抗原的ELISA方法，能够检测到浓度为 0.5 μg/mL的VP73抗原和2.3×102pfu/mL的全病毒颗粒。此外，以昆虫细胞表达的 p30蛋白作为包被抗原，建立的检测ASF抗体的ELISA方法，敏感性与OIE推荐的ELISA的敏感性相当，特异性高于 OIE推荐的ELISA。该方法在检测早期感染的样品时具有更高的敏感性，可以用于ASFV特异性抗体的早期检测。

Gallardo等利用重组蛋白pK205R，pB602L，p104R和p54建立的ELISA检测方法，用OIE推荐的ELISA方法检测的欧洲地区猪血清来评估该方法，结果显示，以蛋白 pK205R，pB602L和p54建立的方法具有较高的敏感性和特异性，与检测ASFV的标准IB结果基本一致。pB602L和p54建立的ELISA检测方法的敏感性要高于 OIE推荐ELISA和蛋白 p30为抗原建立的ELISA方法的敏感性，为ASF的抗体血清学检测提供了更多选择。

3 结语

ASF可通过动物产品的国际、国内贸易，边境互市，野生动物迁徙和昆虫媒介等途径传播，该病的高发病率和高致死率不仅给养猪业造成严重的经济损失。ASFV感染的靶细胞是猪的单核巨噬细胞系统，并以其特有基因编码数量众多、机制复杂的病毒蛋白参与ASFV吸附、侵入宿主细胞、病毒复制与装配、逃避宿主免疫防御系统等功能，使病毒能更有效地感染宿主细胞，引起猪的急性、热性、出血性的临床症状和病理损害。深入地研究ASFV编码基因及相关蛋白的功能，探讨ASFV对宿主细胞的感染机制，将为 ASF的预防和控制以及 ASFV疫苗的探索研究提供重要的理论依据。目前，随着对ASFV生物特性和分子特性研究的不断深入，已从 ASFV感染的细胞中分离鉴定出至少54种病毒蛋白。虽然有些病毒蛋白的功能尚不清楚，但随着对ASFV研究的不断深入，ASFV的致病机制将会越来越清晰。目前，尚无有效的疫苗来预防ASF，因此快速、敏感、特异的检测方法对ASF传播流行的监测至关重要，建立及应用敏感和特异的病原学诊断方法为ASF的有效防控及根除措施的实施奠定了基础。

（摘自《中国预防兽医学报》2012年第10期）