透明质酸锌的合成及在小鼠创面修复中的应用

2019-01-28张海娟章琪露徐颖徐莉菲金柳君许可

温州医科大学学报 2019年1期

张海娟，章琪露，徐颖，徐莉菲，金柳君，许可

（1.温州医科大学药学院，浙江温州 325035；2.温州大学生命科学研究院，浙江温州 325035）

皮肤损伤是临床上的常见病与多发病，而透明质酸在体内主要发挥维持细胞外基质环境以及细胞修复等功能[1]。近年研究发现透明质酸具有良好的生物相容性以及在创面愈合中的生物活性等，逐渐应用于创面敷料或组织工程等领域[2]。锌剂具有较强的皮肤收敛和杀菌作用，因此将透明质酸与锌结合[3]，但目前国内并无相关品牌，且我国相关基础研究较少。本研究对透明质酸锌制备工艺进行相关改进，并对其理化性质进行鉴定，对其创面愈合效果进行研究。

1 材料和方法

1.1 材料取SPF小鼠10只，雌雄各半，体质量（20±5）g，由温州医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK（浙）2015-0009。透明质酸钠购于山东福瑞达医药集团股份有限公司，氯化锌购于汕头西陇科学有限公司，氯化钠购于天津科密欧化学试剂有限公司，胰化蛋白胨及酵母提取物均购于英国OXOID公司。钠离子仪购于杭州齐威仪器有限公司，原子吸收光谱仪购于美国Thermo公司。

1.2 透明质酸锌合成方法称取0.15 mol/L氯化锌溶液，静置0.5 h后取上清（约为0.1 mol/L），然后逐滴加到透明质酸钠溶液中（0.25 g溶于25 mL蒸馏水）；同时用钠离子仪检测溶液钠离子浓度，记录数据：当仪器数值稳定后，补蒸馏水到50 mL，得到0.5%透明质酸锌溶液。

1.3 原子吸收法检测金属元素含量将透明质酸钠和氯化锌溶液反应过夜后，3 000目透析袋透析1周，期间每隔12 h换一次水，然后取出放置在-80 ℃ 冷冻过夜，再放入真空干燥机24 h以上，待完全冻干后取出。称取冻干后的透明质酸锌稀释成一定浓度溶液，然后用原子吸收光谱仪检测溶液中钠元素和锌元素的含量。

1.4 透明质酸锌抗菌性能检测将大肠杆菌用LB液体培养基培养3～4 h后，分别配制0.5%透明质酸钠溶液，0.5%透明质酸锌溶液，以及pH 5.5的枸橼酸溶液（对照组），取一定量大肠杆菌溶液，加入到上述溶液中混合培养1～3 h，然后取上述混合液100 μL到LB固体培养基中，37 ℃培养24 h，取出计算菌落数。

1.5 动物创面修复实验取10只健康小白鼠，雌雄各半，制备小鼠全层皮肤切除模型，利用八针法将垫圈缝在老鼠背部两侧，伤口对称，然后分别涂上透明质酸锌溶液（0.5%）和透明质酸钠溶液（0.5%），待液体干了之后用绷带将伤口包上，伤口每天涂抹2次，每隔数天拍照记录创面面积。见图1。

图1 小鼠全层皮肤切除模型

1.6 统计学处理方法采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。计量资料用±s表示，多组间比较用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 透明质酸锌的合成利用钠离子检测仪检测溶液中钠离子浓度，当钠离子浓度仪数值不再变化时，停止添加氯化锌溶液。随着氯化锌含量逐渐升高，仪器数值逐渐升高，当添加量约为6.25 mL，反应达到平衡（见图2）。若透明质酸钠完全解离，计算可得反应达平衡时氯化锌添加的理论值应为6.00 mL，排除实验误差，理论值和实际值接近。

图2 氯化锌添加量与钠离子浓度的关系

2.2 透明质酸锌性质鉴定本研究将生产的透明质酸锌溶液进行透析和冻干，然后利用元素分析检测所含锌离子和钠离子含量。经稀释后透明质酸钠中钠离子浓度为0.269 mg/L，锌离子浓度为0.004 mg/mL，而透明质酸锌中钠离子浓度为0.290 mg/mL，锌离子浓度为0.024 mg/mL。透明质酸钠转化为透明质酸锌过程中，1个锌离子取代2个钠离子，钠离子分子量为23，锌离子分子量为65.5；根据元素分析仪所测结果及物质的量换算表明取代下来的钠离子与结合上去的锌离子摩尔比为2:0.9；排除实验误差，接近理论值的2比1。见图3。

图3 干燥后透明质酸锌粉末

2.3 透明质酸锌抑菌实验有研究叙述了透明质酸锌具备抗菌性能[4]，但是未做深入研究。本研究透明质酸锌溶液pH值为5.3左右，因此需要设相同的pH组来验证抑菌效果。由于起始细菌数过高，透明质酸钠溶液组（pH 6.8）和对照组（pH 5.5）未表现出明显差距（1 cm×1 cm）；与透明质酸钠溶液和缓冲溶液相比，透明质酸锌溶液抑菌效果更好，见图4和5。2.4 透明质酸锌促创面修复透明质酸锌的促愈合效果好于透明质酸钠。在第12天和第15天2组创面面积差异有统计学意义（P＜0.05），见图6-7。

图4 不同溶液的抑菌效果

图5 不同溶液对应细菌菌落数比较

3 讨论

创面是正常皮肤或组织在外界致伤因子以及机体内在因素如局部血液供应障碍等作用下所导致的损害。常伴有皮肤完整性的破坏以及一定量正常组织的丢失，同时还有可能使皮肤的正常功能受损[5]。创面损伤愈合包括血液凝固、炎症反应、血管发生、纤维组织形成、上皮化、创面收缩、塑形，是一个多因素参与的复杂而精细的生物学过程[6]。当多种因素造成皮肤愈合不良、形成瘢痕时，不仅影响患者的美观，还可导致患者肢体功能障碍，甚至危及生命。研究发现在创面愈合过程中，细胞外基质起到重要作用，它可以为细胞提供移动的网络和向导，把细胞黏附在一起，对组织的愈合起到骨架作用，并且影响各种生长因子生物活性及其调节作用[7]。胶原蛋白与透明质酸是细胞外基质的主要成分，胶原蛋白在修复上的临床应用已经较为普遍，不少研究发现透明质酸因在无瘢痕愈合方面有明显作用而受到人们越来越广泛的关注[8]。透明质酸及其盐是广泛存在于人体内的生理活性物质，由葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖组成的双糖单位连接而成的一种高分子黏多糖。其中透明质酸钠临床应用较多[9]，在皮肤损伤实验中抗感染是至关重要的一环，但透明质酸钠在此方面较为欠缺。锌被称为“生命元素”，它是所有生物系统必需的微量元素，也是人体必需的14种微量元素之一[10]。研究发现，改善全身或创面局部锌营养状态可促进不同类型的创面修复[11]，此外锌剂具有较强的皮肤收敛和杀菌作用，对外科手术及创面感染有一定的疗效，不少研究也发现锌是一种安全性很好的抗菌金属物质[12]。临床用药炉甘石其有效成分就是碳酸锌和氧化锌，其作用是保护和收敛皮肤[13]。锌离子还可以作为透明质酸钠的阳离子替代物增加治疗效果，透明质酸锌已经被证实是一种新型复合物[14]，因此将透明质酸与锌结合，能更好地发挥协同促创面愈合的作用。但透明质酸锌目前国内没有相关产品、原料等，我国市场主要是被匈牙利吉瑞大药厂所生产的愈肤欣医用透明质酸锌凝胶占据，并且我国相关基础研究还较少[15]。BURGER等[4]发现透明质酸钠不完全解离，但在锌离子作用下，原来与透明质酸盐键合的钠离子能释出，并且随着锌离子浓度增加，钠离子释出也增多，当等当量的锌离子与透明质酸钠反应时，钠离子就能完全释出。本研究通过测得透明质酸钠与氯化锌反应后钠离子浓度的趋势变化并计算出完全反应氯化锌的理论添加值6.00 mL与实际值6.25 mL接近（见图2），证明透明质酸钠完全电离，且该反应为完全反应。匈牙利专利[16]报道了粉末状透明质酸锌的制备工艺：将透明质酸钠溶于水，加入锌盐后用有机溶剂沉淀，再用有机溶剂脱水干燥。此法简单快速，但是盐离子较多。目前国内外采用的是离子交换树脂法，占用设备多，操作较复杂，价格昂贵，因此限制了透明质酸锌的临床应用[17-18]。有研究报道说透明质酸与锌更多的是通过共价键形式连接[19]，本研究也对透明质酸锌该性质进行了鉴定，这提示我们可以通过控制氯化锌的添加量，使反应杂质达到最低，而透析则利用相对分子质量大小差异将透明质酸锌与杂质进行分离。参考该报道并针对两者工艺的缺陷，本研究通过改进传统的离子交换法，运用透析的方法，去除生成的氯化钠等小分子，制备出纯度较高的透明质酸锌，根据实验结果我们推测透明质酸与锌是以共价键的形式连接，并且在抑菌实验中可见透明质酸锌的抑菌能力明显强于透明质酸钠。本研究通过小鼠全皮切除创面实验来比较透明质酸钠和透明质酸锌促进创面愈合效果，结果表明透明质酸锌组的小鼠伤口愈合比透明质酸钠组更快，证明透明质酸锌具有协调促修复作用。但本实验还缺乏对透明质酸锌促进创面修复的机制研究，如是否对于血管损伤有影响或是否在促进某种蛋白质的增加等，因此接下来我们将重点研究其分子机制。