枸杞提取液的活性成分分析及其抑菌性、抗氧化性

史 蓉，周 丽，段 亭，王 蓉

(酒泉市食品检验检测中心，甘肃酒泉735000)

枸杞(Lycium barbarum)是茄目茄科枸杞属植物，属卫生部公布的药食同源品种，《本草纲目》记载:“枸杞，补肾生精，养肝，明目，坚精骨，去疲劳，易颜色，变白，明目安神，令人长寿”［1］，在我国的食品、保健品和医药业方面占据了重要地位。GB/T 18672－2014《枸杞》［2］将枸杞分为四个等级:特优、特级、甲级、乙级;枸杞的外观品质主要有:形状、杂质、色泽、滋气味、不完善粒质量分数、无使用价值粒、粒度、百粒重，这些决定着枸杞的商品特性;蛋白质、脂肪、总糖、枸杞多糖、黄酮、类胡萝卜素、甜菜碱等决定着枸杞的营养及药用价值。

目前，尽管许多人工合成的抗氧化性物质如丁基对苯酚(BHQ)、丁基羟基茴香醚(BHA)等可以抑制氧自由基反应的发生，但基于安全性方面的考虑，合成抗氧化剂的使用越来越多的受到限制，因而，近年来，从天然植物中寻找高安全性的天然抗氧化物质引起人们广泛关注［3］。有研究得出，甜菜碱是枸杞中的主要药效成分之一，具有良好的稳定性及抗氧化性［4］，但目前还未见将枸杞提取液直接作用于易氧化的动物油脂，直接反映其抗氧化作用的报道。枸杞多糖对细菌、霉菌有一定的抑制效果［5］，但细菌性食物中毒的患者一般都表现有明显的胃肠炎症状，评价枸杞提取液对常见肠道致病菌的抑菌效果更有意义。

因此本实验以酒泉枸杞为研究对象，对提取液中的枸杞多糖、甜菜碱、总酚这3种功能性成分进行测定，分别用两种方法测定提取液抑菌性和抗氧化性，以期对枸杞的深加工和功能性开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

特级枸杞 产地酒泉;猪油 市售;金黄色葡萄球(Staphylococcus aureus)ATCC25923、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)ATCC27853、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ATCC25922、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)ATCC14028 广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心;营养琼脂 北京陆桥;抗坏血酸、没食子酸、葡萄糖 甜菜碱 分析纯，天津市天新精细化工开发中心;蒽酮、无水乙醇、碳酸氢钠、草酸、铁氰化钾均为分析纯 天津市百世化工有限公司;福林酚(Folin－Phenol) 阿法埃莎(中国)化学有限公司;圆滤纸片(直径10 mm，厚度1.5 mm) 新华滤纸。

LDZX－75KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;SPX－250培养箱 上海跃进医疗器械有限公司;BHC－1300ⅡA2型生物安全柜 苏州安泰空气技术有限公司;PL602E电子天平、FE20型pH计 梅特勒托利多仪器有限公司;SP－756P紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;CS－9000薄层扫描仪 日本岛津。

1.2 实验方法

1.2.1 枸杞提取液的制备 参考GB/T 18672－2014《枸杞》附录A［6］，取枸杞样品于80℃干燥6 h，粉碎均匀，分别准确称取 2.00、5.00、10.00、15.00、20.00 g 样品，置于圆底烧瓶中，加80%乙醇溶液80℃水浴回流提取1 h，趁热过滤。残渣用热水洗至原瓶，加水200 mL，沸水浴回流提取2 h，提取其中所含的有效成分，趁热过滤，洗液并入滤液，冷却后移入200 mL容量瓶中定容，制成1.0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%的提取液。

测定枸杞提取液中枸杞多糖、总酚、甜菜碱3种有效成分的含量，因称样量高于国标，为避免吸光度过高不能读数，选取1.0%的提取液为测定样。

1.2.2 枸杞多糖的测定 参考GB/T 18672－2014《枸杞》附录A［6］制作标准曲线，枸杞多糖标准曲线:y=0.00573x+0.01402(R2≥0.99)。取1.0%的样液1 mL加纯水和苯酚液各1 mL，滴加硫酸5 mL，振荡混匀，沸水浴加热15 min，冷却至室温490 nm波长下测定吸光度，根据标准曲线确定吸取的待测液中葡萄糖的质量(μg/mL)，按公式1计算枸杞中的枸杞多糖含量。

其中:W1为枸杞多糖含量(%)，3.19为葡萄糖换算多糖换算因子，A为提取液中葡萄糖浓度(μg/mL)。

1.2.3 总酚的测定 使用Folin－Ciocalteu法进行测定［7－8］，样品总酚含量%以没食子酸来表示。取1.0%的样液1 mL加10%福林酚5 mL，7.5%的Na2CO3溶液4 mL，摇匀，室温下放置60 min，765 nm波长下测定吸光度。取1 mg/mL没食子酸溶液稀释成0.1 mg/mL，再 稀 释 成 0.015、0.030、0.045、0.060、0.075 mg/mL，同一条件下制作标准曲线，没食子酸标准曲线:y=0.0093x+0.0319(R2≥0.99)，根据标准曲线确定吸取的待测液中没食子酸的质量(μg/mL)。按公式(2)计算样品总酚含量。

其中:W2为枸杞总酚含量(%)，A为提取液中没食子酸浓度(μg/mL)。

1.2.4 甜菜碱的测定 采用《中国药典》［1］中枸杞子甜菜碱的测定，薄层色谱法。

1.2.5 枸杞提取液抑菌效果的测定

1.2.5.1 菌悬液的制备 选取4种肠道致病菌:金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌的二代斜面培养物，无菌条件下分别挑取适量菌苔，用无菌水稀释制成102～105CFU/mL之间的菌悬液。

1.2.5.2 圆滤纸片法 圆滤纸片分别放入2.5%、5.0%、7.5%、10.0%的4个不同浓度的枸杞提取液中，121℃灭菌15 min。分别将金黄色葡萄球菌、铜绿假单菌、大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌菌悬液吸取0.1 mL，均匀涂布于营养琼脂平板表面，用无菌镊子将滤纸片贴于含菌平板上，每个平板均匀贴4张不同浓度的滤纸片。操作完成后平板置于36℃培养箱内培养24～48 h，取出测量抑菌圈直径。

1.2.5.3 菌落计数法 营养琼脂的配制方法为3.3 g营养琼脂粉，加100 mL纯水溶解，用2.5%、5.0%、7.5%、10.0%，的枸杞提取液代替纯水配制营养琼脂，121℃高压灭菌15 min，备用。吸取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌菌悬液各1 mL于无菌平皿中，倾注4个不同浓度的枸杞提取液配制的营养琼脂15～20 mL，平板置于36℃培养箱内培养24～48 h，计数各平板菌落数(CFU/mL)，纯水配制的营养琼脂为空白对照，抑菌率用公式3计算。

式中:n1:纯水营养琼脂中菌落数;n2:不同浓度枸杞提取液琼脂中菌落数。

1.2.6 枸杞提取液抗氧化效果的测定

1.2.6.1 枸杞提取液对猪油的抗氧化作用 取25 g猪油于40 mL烧杯，分别加入2.5%、5.0%、7.5%、10.0%的枸杞提取液10 mL，混合均匀覆盖封口膜，设置空白对照，0.1%BHA为阳性对照。油样于40℃恒温培养箱内存放，每24 h搅拌一次，每隔3 d准确称取2～3 g猪油于锥形瓶中，按GB5009.227－2016食品中过氧化值的测定中第一法滴定法［9］测定其过氧化值，连续测定24 d。

1.2.6.2 枸杞提取液还原能力的测定 参考Liu等［10］的方法稍作修改。10 mL的离心管中分别加入0.2 mol/L pH6.6的磷酸缓冲液2.5 mL和不同浓度(1.0%、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%)的枸杞提取液1 mL，加入2.5 mL1%铁氰化钾，混匀，50℃反应20 min，取出加2.5 mL 10%三氯乙酸终止反应，5000 r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.3%三氯化铁，混匀静置10 min，在700 nm处检测吸光值，吸光度越大，还原能力越强，抗氧化性越强。以蒸馏水为空白，以0.1%～0.5%的VC为阳性对照。

1.3 数据统计分析

每组实验至少重复3次，结果表示为珋x±s，数据采用Excel 2007软件进行统计分析，并用SPSS 21.0软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 枸杞提取液中有效成分分析

枸杞经过乙醇回流除去杂质，热水回流提取，经过计算得出枸杞中3种有效成分含量如表1所示。

表1 枸杞中3种有效成分含量(g/100 g)Table 1 Contents of three activeingredients in wolfberry(g/100 g)

不同地区的枸杞中有效成分含量会有所不同，艾百拉·热合曼等［11］的研究结果显示，自然晾晒干燥的民勤枸杞多糖含量为(1.586±0.16)g/100 g，甜菜碱含量为(1.636±0.20)g/100 g，总酚含量为0.077 g/100 g。本实验得出酒泉枸杞多糖含量为(6.44±0.22) g/100 g，甜菜碱含量为(1.21±0.16)g/100 g，总酚含量为(0.12 ±0.03)g/100 g。相比两个地区的枸杞，在甜菜碱和总酚含量方面相差不大，但本实验得出枸杞多糖含量较高，可能和酒泉地区昼夜温差大，日照时间长有关。

2.2 枸杞提取液抑菌能力分析

2.2.1 圆滤纸片法测定枸杞提取液抑菌效果 本文所选的4种供试菌是食品中常见的肠道致病菌，因此以这4种菌作为测试对象具有一定代表性，由表2可以看出，枸杞提取液对这4种肠道致病都有一定的抑制效果，随着提取液浓度的增加，抑菌圈直径变大。抑菌效果:鼠伤寒沙门氏菌＞铜绿假单胞菌＞大肠埃希氏菌＞金黄色葡萄球菌。枸杞提取液浓度≥2.5%，对鼠伤寒沙门氏菌和铜绿假单胞菌都有抑制作用，枸杞提取液浓度≥5.0%，开始对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌有抑制作用。高春燕等［5］得出，对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，枸杞多糖对它们的抑制作用相当，无显著差异，在10 mg/mL时有抑菌圈，且大约都是10 mm。在本实验中枸杞提取液含量为10.0%时，枸杞多糖含量为0.6 mg/mL，大肠埃希氏菌的抑菌圈为(3.9±0.1)mm，金黄色葡萄球菌的抑菌圈为(1.8±0.2)mm，抑菌能力比单一枸杞多糖强，说明枸杞提取液中其它成分也有抑菌性。

表2 圆滤纸片法测定抑菌效果Table 2 Determination of bacteriostasis effect by circular filter paper method

2.2.2 菌落计数法测定枸杞提取液抑菌效果 从表3可以看出，随着营养琼脂中枸杞提取液浓度的增加，对这4种致病菌的抑制作用越明显，枸杞提取液含量为2.5%时，对大肠埃希氏菌的抑制率超过50%，枸杞提取液含量为5.0%时，对鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑制率超过50%。

表3 菌落计数法测定抑菌率Table 3 Determination of bacteriostasis rate by colony counting method

通过以上两种实验结果可以得出，不同浓度的枸杞提取液对这4种致病菌都有抑制作用，分析抗菌机制有两种可能，一是枸杞提取液中大量的低聚糖类，作用于菌体后，迅速破坏细胞壁和细胞膜的完整性，阻止营养物质以及代谢产物正常穿过细胞膜，使微生物失去营养而致其生长停滞，达到抑菌的目的［12］。二是枸杞提取液中少量的甜菜碱和多酚类物质凝固细菌蛋白，破坏细菌细胞膜结构与细菌遗产物质DNA结合，从而改变细菌生理，抑制生长［13］。枸杞提取液对鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌这3种革兰氏阴性菌的抑制作用较强，圆滤纸片法得出其对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱，菌落计数法得出其对金黄色葡萄球菌的抑制作用较强。可能是因为革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖层次较少，交联程度较低，所以网状结构疏松，较易被破坏，革兰氏阳性菌细胞壁含90%的肽聚糖和10%的磷壁酸，其肽聚糖的网状结构比革兰氏阴性菌致密［12］。圆滤纸片法每片滤纸片枸杞提取液含量少，对细胞壁破坏能力弱，菌落计数法用枸杞提取液配制培养基，每mL有效物质含量高，对细胞壁破坏作用较强。

2.3 枸杞提取液抗氧化能力分析

2.3.1 不同浓度枸杞提取液对猪油的抗氧化作用 由图1可知，经过一段时间氧化，添加枸杞提取液和BHA的猪油POV值明显低于空白对照的POV值，提取液添加量为5%时，与添加0.1%BHA的POV值无显著性差异(p＞0.05)，枸杞提取液添加量为7.5%时，POV值略低于BHA，说明枸杞提取液具有抑制油脂氧化的作用。随着贮藏时间的延长，添加了枸杞提取液的猪油POV值也在增大，但总体低于空白对照。同一时间段，枸杞提取液浓度越大，POV值越低。由此可见，枸杞提取液具有一定的抗氧化作用。

图1 枸杞提取液对猪油POV值的影响Fig.1 Effect of wolfberry extracts on POV value of lard

2.3.2 枸杞提取液的还原能力 还原能力是反映物质抗氧化活性的一个重要指标，还原能力与抗氧化活性呈正相关，还原能力越大，抗氧化活性越高［14］。由图2可知，随着枸杞提取液含量的增加，吸光度逐渐增加，但比VC的还原能力要弱，1.0 mg/mL的枸杞提取液在700 nm波长处的吸光度为0.2760，5.0 mg/mL的吸光度为0.5848，10.0 mg/mL的吸光度为0.8949，均低于0.1 mg/mL的VC的吸光度1.0327，但比灵芝多糖的还原性要强，当灵芝多糖浓度为5.0 mg/mL时，其在700 nm波长处的吸光度仅为0.23［15］，说明枸杞提取液有良好的还原能力。这可能是因为枸杞提取液中含有的总酚、甜菜碱、枸杞多糖等有效成分具有抗氧化效果。李子果皮、果肉总酚都具有一定的抗氧化活性［16］，甜菜碱能有效维持逆境下蛋白质和生物膜的结构和功能［17－18］，多糖抗衰老与其增强机体对自由基的清除和抗氧化能力有关［19］。

图2 枸杞提取液的还原能力Fig.2 Reducing power of wolfberry extracts

图3 VC对照品的还原能力Fig.3 Reducing power of VC control

3 结论

实验结果表明，枸杞提取液具有较强的抑菌能力和抗氧化活性，有机溶剂回流去除杂质，热水浸提其有效成分，检测得出枸杞提取液中枸杞多糖(6.44±0.22)g/100 g、甜菜碱(1.21±0.16)g/100 g含量较高，总酚(0.12±0.03)g/100 g含量较低。枸杞提取液对3种革兰氏阴性菌:鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌的抑制作用较强，对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌抑制作用较弱，抑菌能力随着枸杞提取液浓度的提高而增强。猪油中添加枸杞提取液添加量为5.0%时，与添加0.1%BHA的POV值无显著性差异，枸杞提取液添加量为7.5%时，POV值略低于BHA的，枸杞提取物含量为5.0 mg/mL时，其在700 nm波长处的吸光度为0.5848，高于同浓度灵芝多糖的吸光度，说明枸杞提取液有良好的抗氧化能力。提取液的抑菌和抗氧化作用与其活性成分含量有一定的相关性。本研究针对枸杞有效成分提取和抑菌、抗氧化效果，为深入研究其抗菌保鲜方法提供了依据。