生物及天然保鲜剂在葡萄采后灰霉病控制中应用的研究进展

成培芳，马晓芳，云雪艳，王莉梅，胡 健，董同力嘎

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010018)

葡萄属于葡萄科(Vitaceae)，葡萄属(Vitis L.)，是仅次于柑橘的世界第二大浆果类水果。葡萄因含有丰富的活性物质而具有较高的营养和食疗价值，因此，深受广大消费者的喜爱［1］。然而由于葡萄果实皮薄，柔软且汁液多，因此极易受到微生物的侵害，其中，最常见、危害最严重的病害是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病。该病原菌一旦存在，即使在低温条件下(－0.5℃)也可以迅速传播并扩散至整串葡萄浆果，导致整个浆果的最终腐败，从而失去食用价值和商品价值。每年因灰霉病造成的葡萄产后损失高达20%以上［1］，成为葡萄采后长距离贮运和货架保鲜过程中主要的限制性障碍。

过去的几十年，葡萄在采后贮运过程中，常先采用特克多(噻菌灵)等化学药剂浸果后再进行贮藏［2］。然而，化学农药的长期使用使得病原菌对农药逐渐产生很强的抗药性，最终难以彻底有效控制病害的发生和发展。同时，随着消费者健康和环保意识的不断增强，农药残留引发的人体安全问题以及农药污染引起的环境污染问题逐渐受到人们的广泛关注［3］。世界各国普遍使用的贮藏方法就是冷藏结合SO2的熏蒸处理或SO2的逐步释放等保鲜措施，来管理和控制灰霉病的发生［4－5］，并且在几十年的实践过程中发现，SO2气体对于灰霉菌有很好的抑制作用［6］，例如在密闭环境中进行气态SO2熏蒸处理或采用可释放SO2的保鲜(片材)小袋，均可显著地控制采后葡萄灰霉病的发生发展，但是，对于一些如红地球等不耐SO2的葡萄品种来说，如果在保鲜过程中SO2的使用剂量控制不当，则会引起葡萄浆果表面不同程度的漂白现象［7］，严重的甚至会加速葡萄的霉变腐烂。例如，Zoffoli等［8］的研究发现，当气态 SO2的释放量超过3 mL·L－1·h－1，就会在葡萄浆果表面诱导产生一些用肉眼看不到的纵向微细裂纹，从而使葡萄在贮藏过程中汁液不断渗出，加速葡萄浆果的霉变腐烂，同时对葡萄的风味也会产生影响［9］。因此，在使用SO2缓释垫进行葡萄采后灰霉病抑制的过程中，SO2最佳释放量的研究，一直是研究的重点和难点。同时，有机葡萄生产工艺已不再允许SO2和化学杀菌剂作为葡萄的采后处理方法［10－11］。此外，随着人们对无残留农药果蔬呼声的日益高涨以及有机农业对SO2化学保鲜剂的种种限制，研究和开发高效、环保的可替代SO2型化学保鲜剂用于控制采后灰霉病的新型保鲜技术已成为科研人员研究的热点和重点。

本文阐述了葡萄灰霉病特征及葡萄采后灰霉病的发病症状，综述了SO2替代型生物控制和天然保鲜剂的研究现状与发展前景，以期为今后葡萄采后灰霉病的无公害防治和葡萄贮藏保鲜的实际生产应用提供参考。

1 葡萄灰霉病特征及发病症状

1.1 葡萄灰霉病特征

葡萄灰霉病主要是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的，灰葡萄孢菌是葡萄孢属中的一类丝状子囊腐植营养型真菌，属半知菌亚门丝孢目葡萄孢属［12］。它们以坏死组织为营养，能杀死植物细胞，并在植物的坏死组织上生长发育，其寄主范围十分广泛，能够引起200多种双子叶作物和一些观赏花卉感染灰霉病。灰葡萄孢菌具有多种感染模式，能以菌丝、分生孢子及菌核的形式感染［13］。分生孢子梗具有梗细长，顶端细胞可膨大生成许多小梗的特性，而分生孢子是单胞，分布于小梗上而聚集成葡萄果穗状。因此，当菌丝处于不利环境时，就会形成菌核，然后在2～25℃条件下萌发产生分生孢子梗和分生孢子。

灰葡萄孢菌的生长繁殖具有不确定性和不固定周期性，可在不同生长时期、不同温度下感染不同的植株，感染速度较快，因此，葡萄采后灰霉病的感染存在多种可能，可能是早期果实的感染所致，也可能是成熟期直接感染，这就给采后灰霉病的防治带来了不确定因素，从而增加了防治难度。

1.2 葡萄采后灰霉病的发病症状

贮藏阶段，浆果染病早期在果皮上出现直径2～3 mm的圆形凹陷病斑，果肉仍维持原有硬度，病斑颜色稍浅于周围的正常组织。用手轻擦病斑部位，可见表皮易与果肉分离而发生局部脱落，如果用手按压病斑则病处表皮破裂果肉暴露。葡萄一旦染病后病程发展十分迅速、难以控制。在适宜发病的环境条件下几天后即发生落粒和果实软腐，果皮上开始聚积并产生大量灰至浅黄色的菌丝和分生孢子，使果实完全失去商品价值。

2 葡萄采后灰霉病防治的替代型保鲜剂

2.1 生物控制剂及其复合技术

近年来，为了减少和避免化学杀菌剂带来的健康隐患和环境污染问题，相关文献表明，在生物环境中，利用拮抗微生物进行的生物控制技术在果蔬采后灰霉病的控制方面较传统的化学防腐剂有很大的优势［14－15］。例如，Parafati等［16］研究显示不同种类的酵母菌生物防治剂可不同程度地抑制葡萄浆果采后的发病率、发病程度及病变直径，是一项很有发展潜力的“无硫”保鲜剂。其中常用的生物防治剂主要有生物真菌和生物细菌防治剂。生物防治的保鲜机理主要是微生物可通过拮抗(Antibiosis)、竞争(Competition)、诱导抗性(Induced resistance)等一种或多种机制联合来抑制其它微生物的生长［17］。范三红等［18］的研究表明，洋葱霍尔德氏菌(Burkholderia contaminans B－1)可有效降低“玫瑰香”葡萄的采后腐烂率，与对照相比，果梗腐烂率降低69.6%，果肉腐烂指数降低63.9%。Zahavi等［19］的研究表明，假丝酵母(Candida guilliermondii)对由灰葡萄孢霉引起的葡萄腐烂具有明显的抑制作用，与对照相比，浆果腐烂可减少16%。据报道［20］，在0℃储存50 d后，葡萄有孢汉逊酵母(Hansienaspora uvarum)可显著(p＜0.05)降低灰霉病引起的葡萄腐烂率，使自然腐败从55%降低到15%。此外，如芽孢杆菌对冷藏条件下的“巨峰”葡萄的采后腐烂率有很好的降低作用，与对照组相比，在贮藏60 d后可使葡萄的腐烂率降低60.2%。产气霉菌是一种通过产生挥发性化合物而起到防治灰霉病作用的真菌，经人工接种的葡萄串置于透气性好的聚乙烯包装袋中，在0.5℃的条件下进行贮藏，当接种剂量分别为5和10 g/kg时，发病率可分别减小到5%和4%，而未经接种处理的葡萄浆果的发病率为43%［21］。但是，目前生物防治剂使用最大的瓶颈有两个方面，一是登记注册费用和复杂程度与化学杀菌剂的使用几乎相当，二是生物防治剂的抑菌谱窄，效果缓慢。因此，虽然许多微生物被证实对葡萄灰霉病具有拮抗作用，但国内外的这些拮抗菌大多仅仅停留在实验室研究阶段，没有实现真正的商业化［22］。

以上分别介绍了几种单独用于葡萄采后灰霉病的生物控制抑菌方法，虽然每一种方法都可一定程度地抑制不同品种葡萄的采后灰霉病的发生发展，但是相比化学类抗真菌剂的抑菌效果来说，两种或者两种以上的非化学抑菌剂的组合使用可能更具竞争力。例如Spadaro等［23］的研究发现，在商业方面，单一的拮抗微生物不能提供令人非常满意的采后灰霉病抑菌效果，为了达到较为理想的采后灰霉病抑制效果，一些科研人员尝试将一些环境友好的、无害的化合物与生物拮抗剂组合使用，通过协同作用来控制采后灰霉病的发病［24］。Qin 等［25］报道了采用汉森氏酵母菌结合水杨酸和碳酸氢钠对葡萄进行采后处理，并在25℃，相对湿度90%～95%的条件下进行贮藏，相对于单独使用汉森氏酵母菌，汉森氏酵母菌和水杨酸、碳酸氢钠的结合使用可显著抑制采后葡萄灰霉病的发病率和病斑直径。

2.2 天然抗菌剂

2.2.1 盐类 盐类包括各种金属的各类盐溶液，在果蔬采前和采后通过浸渍或喷洒等手段作用于果蔬表面，通过改变真菌生长的p H，从而达到抑菌目的。Qin等［26］研究了采用0.1%～1%不同浓度的以四硼酸钾形式存在的硼溶液对鲜食葡萄采后灰霉病的抑制效果，结果表明，在0℃的条件下贮藏30 d后，1%的四硼酸钾溶液有最好的抑制效果，可使人工接种的单个浆果葡萄的腐烂率从40%降低到2%～3%。Gabler［27］采用自来水作为对照，分别用不同浓度的碳酸钠，碳酸氢钠，碳酸钾，碳酸氢钾和碳酸氢铵对分离的葡萄浆果进行处理，研究不同盐类对不同品种接种浆果的灰霉病发病率的抑制情况，结果表明，对于接种的“来特”浆果葡萄，在15℃条件贮藏7 d后，碳酸氢铵显示出最好的抑制效果，可使灰霉病的发病率由36.8%降低至2.4%。Konuk等［28］的研究表明，采用藻朊酸盐对鲜食葡萄进行采后涂膜处理，可以显著地抑制灰霉病的发生，同时可以保持更高的总酚含量和抗氧化活性。但是，对于采用盐类溶液进行葡萄采后处理，一个不容忽视的问题就是盐类在浆果表面的残留问题，较为理想的效果是表面的残留溶液在视觉上不可见，否则会影响感官评价结果。

2.2.2 壳聚糖 壳聚糖作为一种天然的可食性保鲜材料，由于其有较好的成膜性、气体选择透过性和抗菌性，被广泛地用做葡萄的采前和采后保鲜包装处理。Romanazzi等［29］的研究发现，用乙酸溶解的壳聚糖溶液，不管是对15℃贮藏条件下的单个浆果，还是0℃贮藏的整小串葡萄簇，在贮藏60 d后，均对葡萄采后灰霉病具有显著的抑制效果。Shiri等［30］用0.5%和1%的两种浓度的壳聚糖对葡萄进行涂膜处理，结果发现，与对照相比，在0℃的条件下贮藏60 d后，0.5%的壳聚糖溶液可使葡萄的腐烂率降低68.6%，而1%的壳聚糖溶液可降低腐烂率65.1%，由此可见，在低温条件下贮藏，壳聚糖浓度在0.5%～1%范围内变化时，对葡萄采后由灰霉病引起的腐烂率的抑制没有形成显著差异。

2.2.3 芦荟胶 芦荟胶作为一种新型的有效的绿色处理剂被广泛用于多种果蔬的商业涂膜保鲜包装中［31］，其保鲜效果与其组成有密切的关系［32］。芦荟胶富含多种生物活性物质，如维生素、酶类、矿物质、木质素、皂苷、水杨酸及酸胺。采用Serrano的专利配方组成，不论是采前还是采后处理，芦荟胶对鲜食葡萄的灰霉菌有显著的抑制效果［33］。Farahi等［34］研究发现不同体积比的芦荟胶对葡萄采后霉变有不同程度的抑制作用，其中体积比为2∶1的芦荟胶处理组可显著降低葡萄采后灰霉病的发病率，同时也可减少葡萄的失重率和保持较好的感官品质。葡萄串在采摘前1 d用芦荟胶溶液进行喷洒处理，然后在2℃下贮藏35 d时，葡萄浆果的烂果率仅为1%，显著低于对照组的15%。

2.2.4 植物生长调节剂 植物生长调节剂是一类与植物激素具有相似生理和生物学效应的物质，包括人工合成的具有与天然植物激素相似作用的化合物和从生物中提取的天然植物激素，通常主要用来调整植株生长、促进坐果和促使果实膨大。但是，一般使用植物生长调节剂后都会不同程度地降低葡萄的抗病性，并且如果反复多次使用，有可能会使灰霉病对经调节剂处理后的葡萄结构产生一定的敏感性。例如，当Zoffoli对“汤姆森无籽”葡萄两次使用赤霉酸后，葡萄灰霉病的发病率为1%，但是8次使用赤霉酸并加大使用剂量时，灰霉病的发病率将会增加到12%，其主要原因是葡萄浆果对多次使用的植物调节剂赤霉酸产生了敏感性，使葡萄产生不同程度的落粒和裂果，主要表现为浆果表面的微小细裂纹以及浆果的分裂，另外还会使果粒膨大，果梗变粗变硬，从而增加灰霉病害的发病几率［35］。

2.2.5 植物提取物 植物提取物是以植物为原料，根据最终提取物的用途，经过物理化学提取分离过程，定向获取和浓集植物中的某一种或多种有效成分，而不改变其有效成分结构而形成的产品。按照提取植物的成分不同，形成甙、酸、多酚、多糖、萜类、黄酮、生物碱等;按照性状不同，可分为植物油、浸膏、粉、晶状体等。

关于采用植物提取物来抑制葡萄采后灰霉病的相关研究有很多报道，其中主要集中在各种植物香辛料和中草药研究上。Xu等［36］的研究发现，采后鲜食葡萄簇采用葡萄柚籽提取物溶液浸泡处理后，以未经任何处理组为对照，在0℃下贮藏4周后，葡萄浆果感染率为6粒/kg，而对照组为19粒/kg，当人工接种灰霉菌后，采用葡萄柚籽提取物处理组的浆果腐烂率为18粒/kg，而对照组增加到65粒/kg。对于人为伤害并接种灰霉菌的单个浆果来说，通常用开始出现灰霉病症状的时间来评价处理组的抑菌效果。利用这种方法，Tripathi等［37］的研究发现，采用罗勒油、桃李属和生姜三种不同的香精油进行处理后，葡萄浆果开始出现灰霉病症状的时间分别为8、9和10 d，而对照组在4 d就开始出现灰霉症状。Valero分别采用丁香酚和百里香酚精油对葡萄簇进行浸泡处理，然后在1℃下贮藏56 d后发现，浆果的腐烂率较空白组的50%分别降低了80%和56%［37］。香芹酚对灰霉菌也有一定的抑制作用，Martínez等［38］研究发现0.05、0.2、0.5、1.0 mL/L四种不同浓度的香芹酚蒸汽均可完全抑制灰霉菌在马铃薯琼脂培养基上的生长繁殖，且对单个葡萄浆果进行贮藏发现，当采用最高浓度1.0 mL/L的香芹酚蒸汽处理后，在25℃下贮藏4 d，可使浆果的腐烂率由空白组的93%降低到6%。Melgarejo等［39］采用三种不同形式、不同浓度的肉桂叶油研究其对采后葡萄浆果灰霉菌的抑菌效果，研究发现，经肉桂叶油乳液形式浸泡处理(浓度为5 g·L－1)，可显著降低葡萄浆果的腐烂率;采用肉桂叶油蒸汽喷洒处理较乳液浸泡处理有更好的抑制效果，所有试验浓度均可显著抑制葡萄浆果的腐烂;而如果采用涂膜处理方式，则在贮藏15 d后，葡萄浆果的腐烂率为0。由此可见，肉桂叶油采用蒸汽或涂膜这两种处理方式可显著抑制由灰霉菌引起的采后葡萄浆果的腐烂。Gatto等［40］通过对不同草本植物提取物的活性进行体外和体内试验发现，小地榆(Sanguisorba minor)提取液处理对灰霉菌显示出最好的抑制效果，其次是园齿木荷提取液;另外，采用花叶滇苦菜(Sonchus asper)提取物对红提葡萄进行采后处理，相对于空白组，可使葡萄浆果灰霉病的发病率降低42.6%。吕明珠等［41］采用0.1%、0.5%、1%三种不同浓度的肉桂精油保鲜液对红提葡萄进行喷洒处理后置于不同的温湿度条件下进行贮藏发现，肉桂精油保鲜液的抑菌作用在2℃低温、90%RH的高湿条件下发挥更充分，经体积分数为1.0%的肉桂精油处理可显著降低红提葡萄的烂果率，具有较好的抑菌效果。

3 展望

由葡萄孢属引起的灰霉病是葡萄贮运过程中最致命的病害之一，由于其具有腐生性强、寄主范围广、潜伏期长等特点，因此，采用化学杀真菌剂和SO2类保鲜剂进行防腐保鲜，是目前采后灰霉病防治的主要途径。然而，随着有机葡萄产业的蓬勃发展和消费者对化学杀菌剂在水果表面残留问题的广泛关注，高效、安全、环保的新型SO2替代型保鲜剂的研究与开发成为葡萄采后灰霉病抑制的主要研究方向。生物防治技术作为一种新型的用于葡萄灰霉病控制的无公害防治技术，由于存在试验菌株有限、试验场所单一(实验室或田间)，抗菌效果不稳定和成本较高等缺陷，因此，很大程度上限制了其在葡萄采后商业化方面的大量应用。今后的研究方向应着力于对现有的生物防治剂进行改良处理，筛选种类更多的菌株，并通过建立影响生物活性基因的菌株库，采取导入基因的方法来延长生物防治剂的活性，进而提高灰霉病的抗菌效果。

对于非化学抑菌剂，通常是一些天然抗菌剂，抑菌效果有限，并且大多数的非化学抑菌剂的研究仅停留在实验研究阶段，因此要实现SO2替代型保鲜剂的广泛使用，应从以下三个方面努力:一是在使用手段上，将非化学抑菌剂的采前预处理作为葡萄采后抑菌的主要手段，同时加快开发更加有效稳定的抑菌剂的研究进程，着力于天然保鲜剂的组合或复配工艺的研究和使用，并通过进行大规模的活体抑菌实验，逐步扩大其实际商业化应用范围，提高针对性和适用性;二是提高消费者和零售商的无农药残留意识，并加大有机葡萄产业的监管力度，逐步减少或禁止SO2类化学保鲜剂的使用;三是逐步提高社会对SO2替代型保鲜剂商业化应用的接受程度。

SO2替代型保鲜技术专业在我国才刚刚起步，然而，随着非化学抑菌剂对葡萄体外和活体内研究的不断深入，葡萄采后灰霉病防治技术将日臻完善，发展潜力巨大，有望最终取代传统的SO2抑菌技术。