发酵液多糖提取方法的研究进展
2019-01-26徐慧婷张玉国王林平薛文娇范欣阳王子涵王宏伟
徐慧婷,王 颖,张玉国,王林平,赵 敏,于 淼,薛文娇,范欣阳,王子涵,王宏伟,*
(1.东北林业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150040;2.长白山森工集团,吉林延吉133000)
多糖是一种广泛分布于自然界的生物高分子,由于其能改变水的液流性,常作为增稠剂应用于食品、化妆品等领域;由于多糖作为免疫系统的组成部分,能有效增强免疫力,是医药研究的重要方向之一。动物、植物、微生物都可以合成自身的多糖,动物植物多糖的生产多局限于地区和气候等自然问题且培养成本高昂,微生物多糖的发展受地区气候限制较少,培养成本较少,利于其工业化大批量的生产加工;且微生物生存环境各异,产生的多糖种类较多,部分多糖利用价值高于动植物多糖,如右旋糖酐作为血浆代用品;黄单胞杆菌产生的黄原胶作为食品添加剂;葡聚糖对吞噬细胞的积极作用,有效增强免疫力。由于微生物多糖的作用价值渐渐被发现,其提取工艺的研究显得尤为重要。微生物发酵液内成分比较复杂,含有微生物和胞外代谢物质[1]。发酵液内的多糖成分具有抗氧化[2-5]、抗肿瘤[6-8]、抗衰老[9-10]等活性,具有医用价值和商业价值[11],所以其提取工艺的研究有很大意义,故本文对近年来的发酵液多糖的提取方法进行了概述。
1 发酵液多糖定义与分类
发酵液多糖是指由微生物发酵过程中产生的碳水化合物。按多糖存在位置分,可分为胞内多糖和胞外多糖两类[1]。胞内多糖存在于细胞内的质膜表面或内部以储存能量,胞内多糖作为储能物质分子量较大,不易穿过细胞[12]。胞外多糖是在生长代谢过程中分泌到胞外环境中(附着在细胞表面和分泌在培养基)或通过胞外分泌酶合成的一类分子量较小的多糖,较小的分子量利于穿过细胞膜分泌到细胞外[13-15]。胞内多糖与胞外多糖由于功能不同以及存在位置不同,两者结构的差异主要在于分子量差异与单糖组分差异[16]。大多数提取发酵液多糖实验直接将胞内多糖与胞外多糖一起提取,但由于胞内多糖与胞外多糖活性不同,部分实验采取分开提取。从方法上来看,由于胞外多糖大部分存在于液体培养基,胞外多糖提取只需要作用于液体培养基;胞内多糖由于存在于细胞内部,需要多一步细胞破碎,使胞内多糖游离到细胞外。细胞破碎过程中可能会导致部分多糖被破坏,所以是胞内多糖提取过程较重要的一步。
2 发酵液多糖的提取方法
史美丽等[17]通过比较灰树花不同阶段发酵液多糖的含量得出,发酵液多糖有胞内多糖和胞外多糖之分;且不同时期胞内多糖和胞外多糖含量不同,说明发酵液多糖的提取时期随主要提取物质不同应有所调整。
2.1 发酵液胞外多糖的提取方法
发酵液的胞外多糖多存在于液体培养基中,少量存在于微生物细胞内,常用的提取方法为水提法,由于部分发酵液中含有水,可直接取发酵液的液体部分,浓缩干燥,得到粗多糖。水提法原理在于多糖能溶于水,所以提取过程只需要水浸泡,成本低廉,对设备要求低、操作简单,但是耗时且纯度低,所以常用一些辅助手段辅助水提法。比如通过有机溶剂沉淀法、脉冲电场处理以及超声波处理。
2.1.1 有机溶剂沉淀法 多糖是生物高分子,溶于水溶液而不溶于有机溶剂,所以可用有机溶剂作为沉淀剂辅助水提法提取。该方法提取原理是:有机溶剂浓度的改变会导致溶液中介电常数变化,介电常数的降低使多糖溶解度降低,从而沉淀出来[18]。所以有机溶剂的介电常数越低,应该越利于多糖的沉淀,丙酮介电常数小,沉淀多糖能力强,也常作为沉淀剂;乙醇无毒且介电常数较小,多使用乙醇为沉淀剂。
有机溶剂沉淀法关键在于溶剂。例如张涛等[19]在单因素试验中用体积分数不同的乙醇沉淀发酵液,发现当乙醇浓度较低时,得到的主要是大分子多糖和杂蛋白;乙醇浓度较高时,得到的是小分子多糖,可能是由于多糖分子与醇溶蛋白的结合。闫训友等[18,20]通过正交试验考察了乙醇沉淀法的温度、浓度、时间三因素对提取率的影响,最佳工艺中要优先考虑温度因素。闫训友等[20]在乙醇法提取阿魏侧耳发酵液多糖试验中得到温度过高会导致多糖裂解,结构变化,溶剂渗透能力和溶解能力有所增强。
有机溶剂沉淀法是利用有机溶剂改变溶液的介电常数以沉淀多糖,溶剂的介电常数影响提取率,应选用合适的溶剂提取,过程中关键在于溶剂,所以成本较低,操作较简单。
2.1.2 几种新型提取法 目前胞外多糖的提取虽然还是以有机溶剂沉淀法为主,但是随着胞外多糖的发展,也渐渐出现了几种新型的提取方法,只是相关研究较少。
高压脉冲电场法就是在水提法和有机溶剂沉淀法工艺基础上加上脉冲电场辅助提取,用高压脉冲电场处理含有微生物的发酵液,可能使附着在微生物表面的胞外多糖脱落,游离于发酵液中,可有效提高多糖提取率,更具经济效益,但可能会破坏多糖分子的完整性。张铁华等[21]通过高压脉冲电场处理后提取的多糖含量较传统提取法提高了84.30%,且耗时短、耗能低、效率高。多糖提取率随电场强度增大先升高后降低,可能是由于电场强度过大,导致多糖分子断裂。
超声波提取法提取胞外多糖是通过超声波处理微生物发酵液辅助提取,超声波处理产生的空化作用,热效应以及机械振动作用更利于微生物表面多糖的脱落、溶解,可有效提高多糖提取率,有效缩短提取时间。李堆淑[22]的超声波辅助乙醇沉淀法提取黄链霉菌胞外多糖的单因素试验中,超声波功率的升高导致胞外多糖浓度先增高后下降,可能是由于超声波功率过高导致部分多糖结构被破坏。
2.2 发酵液胞内多糖的提取方法
发酵液的胞内多糖多存在于微生物细胞内,所以提取时需要将微生物与发酵液分离,然后破碎微生物细胞。传统水提法即通过水浸泡使细胞破裂,对提取物质损害少,但提取效率较低,最简易的破碎细胞方法即人工粉碎微生物细胞,现多采用高压脉冲、微波、超声波、酶等辅助破碎细胞。
2.2.1 溶剂提取法 水或者有机溶剂加入物料中浸泡、提取的方法是目前提取多糖最常用的。一般都采取热水进行浸泡提取,还有个别原材料需要加入一些弱酸或弱碱,才能提取出其中的多糖物质,而液体原料仅需要加入乙醇等有机溶剂进行直接沉淀提取多糖。固体原料在水提后还需要用乙醇沉淀提取[23]。
溶剂提取法的关键在于溶剂的选择。孙居民等[24]通过研磨破碎金针菇菌丝体后用热水提取,最后用乙醇沉淀。试验通过提取液与95%乙醇不同体积比提取,得到加入3倍乙醇最适合。李羿等[25]通过碱提取法对茯苓碱溶性胞内多糖的提取工艺的提取温度和碱性溶液浓度进行了单因素实验,得出随着温度的升高,碱溶性多糖提取率减少,碱性多糖提取率随着NaOH浓度升高先升高后降低,实验得到NaOH最佳提取浓度为1.0 mol/L。
通过加入溶剂使溶液中多糖溶解度改变,使多糖沉淀出来,也有可能沉淀出蛋白质等杂质,所以纯度不高;过程只需人工破碎微生物、添加溶剂沉淀多糖,所以操作简单、对设备要求不高、成本低廉。
2.2.2 高压脉冲提取法 高压脉冲可使细胞膜电位发生变化,膜通道打开,细胞内外物质交换,渗透不均匀性瞬间使细胞破碎,组织流出[26]。高压脉冲可在相对低的温度和较短时间内破碎细胞,且能耗较低[27],适于多糖的提取。
高压脉冲能在短时间内破碎细胞,张若兵等[28]利用双荧光染色法以及流式细胞仪量化了高压脉冲对小球藻细胞的破碎效果,电场强度与脉冲注入能量密度越高,细胞破碎效果越好且耗时短。殷涌光等[29]通过比较高压脉冲电场提取法(49.8%)、热碱提取法(29.8%)、微波辅助提取法(44.2%)和超声波辅助提取法(51.2%)提取桦褐孔菌多糖的提取率,发现高压脉冲提取法的提取率仅次于超声波提取法;又通过比较高压脉冲电场提取法(25.6%)、热碱提取法(22.4%)、微波辅助提取法(20.5%)和超声波辅助提取法(18.3%)提取桦褐孔菌多糖的纯度,发现高压脉冲提取法提取率是超声波辅取法的1.40倍,脉冲电场辅助提取所得多糖杂质较少,纯度较高。马凤鸣等[30]通过脉冲电场法提取黑木耳多糖提取率(8.86%)高于超声波处理辅助(7.24%)提取率,说明脉冲法破壁效果较好,且脉冲电场法(0.0024 J/g)提取多糖能量消耗较超声波法(7.2661 J/g)也少。
通过高压脉冲产生膜穿孔来破碎细胞,能在瞬间破碎细胞,耗时短;需要高压脉冲系统,与超临界流体萃取法和亚临界水提取法相比成本较低,设备普遍性高,使用较简单。破碎过程中温度快速升高[31],节省加热过程,不利热敏性多糖的提取。
2.2.3 酶提取法 酶法提取法的原理是通过酶对细胞壁、细胞膜和细胞质膜的酶解作用,使细胞内物质获得最大程度的释放[32]。可与溶剂沉淀法一起使用,酶可以温和分解细胞,加速胞内多糖释放提取,提取效率较溶剂法明显提高。由于酶的专一性和选择性,应该用不同的酶对不同底物作用以提高提取率[33],所以复合酶作用比单一酶作用提取率高[34]。
酶法提取多使用混合酶提取,且一定程度上可以减少蛋白杂质。陈娜[35]的灵芝发酵液多糖提取试验中,酶法辅助提取(2.35%)灵芝胞内多糖提取率明显高于热水提取法(1.78%)。蔺红苹等[36]通过试验比较了碱法、酸碱法和酶碱法提取啤酒酵母细胞壁中葡聚糖的提取率,得到多糖提取率最低的为碱法,最高的为酶碱法(73.67%),且纯度较高,蛋白杂质酶碱法(8.16%)较碱法(15.28%)和酸碱法(12.43%)明显减少,证明了酶法辅助提取除了提取率高以外,还能降低提取液内的蛋白杂质。刘宁和李健[37]通过酶提取法提取香菇多糖,使用混合酶提取香菇多糖的提取率比水提法高出6.26%,在时间上缩短了2/3,且杂质含量较少。
通过酶反应来破碎细胞,优点在于酶促反应温和,适于不能经历激烈反应物质的提取,不会破坏多糖成分,多糖活性较高。酶促反应破碎细胞效率远高于水提法,耗时短且能耗低。但是选择到合适的酶有困难,且部分酶不好回收,容易引入杂质。
2.2.4 超声波提取法 超声波是一种频率高于20000 Hz的声波,作用于液体时产生空化作用,液体内小气泡产生并膨胀,并突然破碎,产生瞬间高温高压,一定的冲击波和高速射流破碎细胞;超声波产生的机械振动和热效应利于物质溶出[38-39]。
超声波能较为高效地破碎细胞,利于多糖的提取,但也存在破坏多糖结构的问题。Simon Bystryak等[40]通过超声波破碎酿酒酵母细胞实验,得出超声波破碎细胞效率高于高压破碎和珠磨破碎,且能更有效地使物质与膜分离,利于提取与膜结合的多糖。胡小军[41]通过正交试验设计确定了超声时间是影响多糖得率的最关键因素。多糖得率随超声波时间的增加而升高,达到最大值后不再出现明显升高,且长时间作用会使部分多糖由于超声波的机械作用而断裂,结构被破坏,得率反而下降[42]。吴霞等[43]通过提取阿里红多糖证明了超声波提取法(1.01%)较常规热水提法(0.81%)得率高且耗时短,是比较可取的具有经济效益的提取方法。
超声波辅助产生的空化作用、热效应和机械作用是影响提取率的主要原因,空化作用能产生极大压力,瞬间破碎细胞,耗时短且能耗低,热效应和振动机械作用会加速胞内物质释放、溶解,利于提高多糖得率。由于超声波法理想温度在40~60℃,对热敏感分子损害较小[44],利于热不稳定多糖的提取。且超声波设备较为普遍,设备操作简便,成本较低,具有经济效益。
2.2.5 微波提取法 微波是频率在300 MHz~300 GHz的电磁波。微波能直接作用于细胞内部,由于细胞内水分含量较高,能快速被加热,高温使内压过大导致细胞破碎,形成孔洞,溶剂进入细胞,溶解并释放多糖物质[45-46],是较理想的多糖提取方法。
微波能促进细胞破裂以及多糖物质的溶出,减少提取时间,利于多糖提取。樊黎生等[47]通过微波辅助水提法(13.26%)提取黑木耳多糖得率比常规水提法的得率提高约51%,且提取时间缩短了大半,说明了微波提取法具有提取率高耗时短的优点。章银良等[48]微波预处理和水提法提取发酵细胞多糖实验中,酵母细胞内含有海藻糖酶,可以降解海藻糖,影响发酵细胞多糖提取,而微波可以使海藻糖酶迅速失活,利于发酵细胞的多糖提取。
微波提取法是通过微波产生热量,加热体系促进有效物质的释放溶解,较水提法耗时短提取率高。微波在极性溶剂下才能释放能量加热溶液,需要极性溶剂作为介质。由于微波的加热,部分多糖结构会破坏,影响多糖活性。多数实验室具备微波相关设备操作简单,成本不高。
2.2.6 超临界流体萃取法 超临界流体是温度和压力都超过临界值的高密度流体,状态处于气体和液体之间,通过改变温度和压力导致密度发生较大变化,也就是说其溶解能力也会随之改变,可作为溶剂提取目标物质[49]。超临界流体萃取是目前较前沿的方法之一。
超临界流体具有高溶解能力和高渗透能力利于多糖的提取。樊黎生等[47]通过超临界萃取法提取黑木耳多糖得到的提取率(16.82%)高于微波辅助萃取法(14.05%)和超声波萃取法(15.43%)。张素霞[50]通过超临界CO2辅助提取法和传统热水提取法提取香菇多糖,超临界辅助法的多糖提取率比传统方法高3.16%,耗时是传统方法的1/5,可能由于超临界流体的高溶解能力和高渗透能力促使提取耗时短。较之于酸碱溶剂法和酶法,超临界流体分离较为方便,减少杂质污染。
超临界萃取法就是利用超临界流体的高渗透能力和高溶解能力实现萃取[51],耗时较传统方法较短。超临界流体由于其特殊状态,较其他常规萃取剂而言更易分离,能实现无溶剂残留,不对产物产生污染,且超临界流体可以反复利用,降低了成本。操作温度较低,比如常用的超临界流体CO2的临界温度是31.1℃,对有效物质的损害较小,利于热敏感性、易氧化物质的提取与分离。常用的CO2萃取剂对环境无害,可以称之为绿色无污染的工艺,只是该工艺设备较复杂,成本较其他方法高,使用不是很广泛。
2.2.7 亚临界水提取法 亚临界水提取法是目前研究较多的方法之一,由于萃取剂为对环境无害的水,其绿色无污染日益受研究者关注。亚临界水即温度高于沸点100℃低于临界温度374℃的在外加压力下,仍然保持液态的水,此时这种溶液介电常数和极性发生变化,溶解能力增大,性质近似有机溶剂[52-53],较适合提取中极性和非极性有机化合物,对低极性化合物溶解度很低[54-55],且提取的多糖产量高,活性高[56]。
水达到亚临界水状态溶解度增大,利于多糖物质的释放溶出。程斌[57]在亚临界水萃取金针菇中多糖研究中提取率为5.21%,证明了亚临界水萃取法提取多糖的可行性,且具有耗时短、提取率高的优点。包怡红等[58]用亚临界水提取法(24.23%)提取黑木耳多糖,与水浸法[59](5.03%)、酶提取法[60](9.95%)、微波辅助法[61](16.24%)、超声波辅助法[62](16.32%)相比较,亚临界水提取法提取率最高。
表1 不同发酵液胞内多糖提取方法的比较Table 1 Comparison of extraction methods of fermentation liquid intracellular polysaccharides
亚临界水提取是利用亚临界状态的水极性大大降低,从而对有效物质进行提取,由于溶剂为亚临界水,避免了有害物质以及杂质的残留,绿色无污染,这种提取方法清洁,快速,高效,可以实现自动化[63]。但是亚临界水提取装置较为复杂,适用范围不是很广泛。表1比较了发酵液胞内多糖的不同提取方法的优缺点和适用情况。
3 总结与展望
发酵液多糖提取通常是指胞内多糖与胞外多糖同时提取,此时与胞内多糖提取的不同在于不用将微生物细胞与发酵液分离,方法同发酵液胞内多糖的提取方法。提高胞外多糖的提取率的关键在于微生物表面多糖的脱落溶解量,通过水浸泡、高压脉冲以及超声波等手段可以促使附着在微生物表面多糖溶解,利于多糖分离,在通过有机溶剂沉淀法能得到更纯的多糖产物。提高胞内多糖或发酵液多糖提取率的关键在于微生物细胞的破碎,通过酶降解、高压脉冲、超声波、微波处理辅助细胞破碎,使多糖更易释放溶解。现在讨论较多的超临界流体萃取法和亚临界水提取法都是利用压力与温度的改变使溶剂的溶解度改变,从而利于多糖的溶解,这两种方法所用溶剂较易与有效成分分离且无毒害,适用于对安全性要求较高物质的分离,且这两种方法的溶剂对环境没有危害,较为绿色环保,在提倡绿水青山的新时代有较大的发展价值。
如今发酵液多糖的价值特别是药用价值正渐渐被发现、重视,其提取工艺的优化就显得尤为重要,一种适用于工业化大批量生产的方法正等待着被发现。现工业化生产提取多糖主要还是采用溶剂提取法,耗时长且料液比高,经济效益不高,而其他辅助法多还停留在实验室阶段,目前高压脉冲、超声波、酶解、微波已经渐渐应用于工业生产中,有关装置以及工艺专利较多,但多是有关植物油或多酚的提取,发酵液多糖方面还有很大发展空间;超临界流体萃取法和亚临界水提取法相关工艺欧美已经开始应用于工业化咖啡豆的脱咖啡因,国内的超临界流体萃取法和亚临界水提取法相关工艺在装置上仍有一定的差距,随着人们对环境保护的重视,由于这两种方法绿色环保的特点,他们的工业化将具有深刻长远意义和广阔的发展前景。希望这些提取工艺能早日应用于实际工业化生产中,创造经济效益;发酵液多糖的抗癌抗菌等活性能早日应用于医药方面,为人类健康造福。