阿托伐他汀对DN小鼠肾组织SFRP1表达的影响*

孔 静， 田平平， 孟庆敏， 卢雨微， 张国忠， 肖 瑛， 郭 兵， 石明隽**

(1.贵州医科大学 病理生理学教研室， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 3.贵阳市第四人民医院, 贵州 贵阳 550000)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)常见且严重的并发症，是引起终末期肾病的主要原因之一，其发病机制尚不清楚。肾小管间质纤维化是DN进展为终末期肾病的重要病理基础，肾小管上皮细胞向间充质细胞分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在肾小管间质纤维化的发生发展中起着重要作用[1-2]，Wnt信号通路是诱导EMT发生的一条关键信号通路[3-5]，SFRP1是该通路的抑制因子[6]。阿托伐他汀是一种经典的降脂药，有减少尿蛋白排泄、减轻细胞外基质聚集等肾脏保护作用[7]，前期研究发现阿托伐他汀可抑制单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)大鼠肾纤维化时肾组织Wnt4/β-catenin信号通路活化，改善肾纤维化病变，但具体机制尚不清楚[8]。本研究以DN小鼠为研究对象，观察阿托伐他汀对小鼠肾组织Wnt4/β-catenin信号通路及SFRP1表达的影响及延缓DN肾纤维化的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

链脲佐菌素(STZ，美国Sigma)，BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL化学发光试剂盒(北京碧云天生物研究所)，SP试剂盒、DAB显示试剂(北京中杉金桥公司)，逆转录试剂盒(美国Fermentas)，SuperReal PreMix Plus(北京天根公司)。小鼠抗大鼠β-actin(武汉普美生物)，兔抗小鼠SFRP1、Wnt4、β-catenin、E-cadherin、col-Ⅳ(北京博奥森)，α-SMA(美国santa 公司)，山羊抗兔二抗、兔抗小鼠二抗(武汉普美生物)。

1.2 方法

1.2.1分组及处理 雄性清洁级昆明小鼠30只，体质量(30±10)g，购自贵州医科大学动物中心，动物批号SCXK(黔)2012-0001。30只小鼠随机分为正常对照(NC)组、糖尿病肾病(DN)组及阿托伐他汀治疗(Ato)组，每组10只。DN和Ato组小鼠禁食不禁水3 h，给予55 mg/kg STZ腹腔注射、连续5 d、1次/d，NC组给予相同剂量无菌柠檬酸钠缓冲液处理。造模第1周开始，小鼠禁食不禁水3 h后采集各组小鼠尾静脉检测空腹血糖，以造模第2周血糖≥16.7 mol/L判定为造模成功。造模第5周开始，Ato组小鼠给予阿托伐他汀(用0.5%羧甲基纤维素配制成混悬液)20 mg/(kg·d)灌胃4周， NC组和DN组小鼠给予等体积0.5%羧甲基纤维素。

1.2.2标本收集 造模第9周时禁食不禁水3 h，乙醚麻醉后处死各组小鼠，摘除眼球取血，离心取血清-20 ℃保存；解剖分离肾脏，部分肾脏固定于4%中性甲醛液中供石蜡切片用，其余肾脏-80 ℃保存供后期实验用。于处死小鼠前1天用代谢笼收集24 h尿液，记录尿量，离心取上清-20 ℃保存。

1.2.3生化指标检测 小鼠血、尿标本送贵阳金域公司检测血糖、胆固醇、尿素氮、甘油三酯、肌酐及24 h尿蛋白。

1.2.4肾组织形态学观察 用4%中性甲醛固定的肾脏组织制作成厚度约为3 μm石蜡切片，行HE和Masson染色，光镜观察肾组织结构变化。

1.2.5免疫组化染色观察 β-catenin和SFRP1表达 制备好的3 μm石蜡切片按照两步法检测试剂盒进行免疫组化染色，烤片、脱蜡、PBS漂洗、3% H2O2阻断内源性过氧化物酶、微波抗原修复、PBS漂洗、一抗孵育(SFRP1 1∶100，β-catenin 1∶100)过夜，次日取出切片，PBS漂洗、二抗孵育、DAB显色、流水冲洗、胞核复染、上行脱水、中性树胶封片后镜下观察及采集图像。

1.2.6Western blot检测小鼠肾组织SFRP1、β-catenin、E-cadherin 1、α-SMA 1及Col-IV蛋白表达 冰上提取小鼠肾组织总蛋白、BCA法蛋白定量后取50 μg/孔上样，电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭、一抗孵育过夜(β-actin 1∶4 000、SFRP1 1∶400、β-catenin 1∶300、E-cadherin 1∶400、α-SMA 1∶400、Col-IV 1∶1 000)，次日TBST洗膜后二抗孵育1 h，TBST洗膜3×10 min，ECL发光， Bio-Rad凝胶成像系统扫描条带，Image Lab软件分析条带灰度值，用目的蛋白条带灰度值比上内参β-actin条带的灰度值表示蛋白相对表达量。

1.2.7Real time-PCR检测小鼠肾组织SFRP1 mRNA表达 Trizol法提取总RNA，IMPLEN核酸蛋白仪检测RNA浓度和纯度，按照Fermentas试剂盒说明书进行反转录，Real- time PCR反应根据SuperReal PreMix Plus试剂盒设定反应体系，Bio-Rad CFX 96TM荧光定量PCR仪进行检测，以β-actin为内参照，目的基因的相对含量以2-ΔΔCt表示。PCR反应引物由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况和相关生化指标

造模第1周，小鼠血糖逐渐升高，部分小鼠血糖值≥16.7 mmol/L；造模第2周时，全部模型组小鼠血糖值≥16.7 mmol/L；造模第9周时，与NC组比较，DN组小鼠逐渐出现多饮、多食、尿量增多、消瘦及体重减轻。NC组小鼠毛发光亮，饮食饮水正常，体质量持续增加，经Ato治疗后上述症状有所减轻；与NC组比较，DN组小鼠的血糖、尿素、肌酐、24 尿蛋白、甘油三酯及胆固醇均明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)； 与DN组比较，Ato组小鼠尿素、肌酐、24 h尿蛋白、甘油三酯和胆固醇较DN组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠部分血液生化指标比较Tab.1 Mouse blood biochemical indexes

(1)与NC组比较，P<0.05；(2)与DN组比较，P<0.05

2.2 肾组织形态学

HE染色可见NC组小鼠肾小球结构清晰完整，肾小管排列紧密、整齐，肾间质无炎性细胞浸润；DN组小鼠肾小球体积增大，肾小管管腔明显扩张，间质见炎性细胞浸润；Ato组间质炎性浸润细胞明显减少。Masson染色NC组小鼠肾组织未见胶原纤维沉积，DN组小鼠则显示肾小管间质有大量蓝色条索状物质沉积，Ato治疗组上述病变明显较DN组小鼠轻(图1)。

图1 各组小鼠肾组织HE、Masson染色(200×)Fig.1 HE staining and Masson staining of the kidney tissue in each group mice

2.3 免疫组织化学结果

NC组可见肾组织几乎未见β-catenin蛋白表达，SFRP1在肾小管上皮细胞胞浆中有较多棕黄色阳性表达。N组可观察到β-catenin在肾小管上皮细胞胞浆和胞膜阳性表达增多且在核中表达，SFRP1在肾小管上皮细胞胞浆中棕黄色阳性表达较少；与DN组比较，Ato组β-catenin阳性表达减少，而SFRP1阳性表达增加(图2)。

图2 β-catenin和SFRP1蛋白在各组小鼠肾组织中的表达(免疫组化，×400)Fig.2 Immunohistochemical staining of kidney β-catenin and SFRP1

2.4 Western blot结果

与NC组比较，DN组小鼠肾皮质Wnt4、β-catenin、α-SMA和Col-IV蛋白表达显著增多(P<0.05)，SFRP1和E-cadherin蛋白表达减少(P<0.05)。给予阿托伐他汀治疗后，Wnt4、β-catenin、α-SMA和Col-IV蛋白表达较DN组明显减少，而SFRP1和E-cadherin蛋白表达则有所增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

(1)与NC组比较,P<0.05；(2)与DN组比较，P<0.05图3 SFRP1、Wnt4、β-catenin、E-cadherin、α-SMA和Col-Ⅳ蛋白在各组小鼠肾组织中的表达(Western blot)Fig.3 The effect of atorvastatin on expression levels of SFRP1, Wnt4, β-catenin, E-cadherin, α-SMA and Col-Ⅳ

2.5 Real-Time PCR结果

与NC组相比，DN组小鼠肾皮质中SFRP1 mRNA表达明显降低，Ato组SFRP1 mRNA表达较DN组增加，差异有统计学意义(P<0.05)，但仍低于NC组(图4)。

(1)与NC组比较，P<0.05；(2)与DN组比较，P<0.05图4 各组小鼠肾组织中SFRP1 mRNA表达(Real-time PCR)Fig.4 The effect of atorvastatin on SFPR1 mRNA levels in mouse renal cortex

3 讨论

阿托伐他汀是常用的降脂药，同时还具有抗炎、抗氧化等作用。王湘研、陈雪芬等[9-12]研究发现，阿托伐他汀可以改善心肌纤维化和肺纤维化。阿托伐他汀同样也具有抗肾纤维化效应[13-14]，本课题组的前期研究表明阿托伐他汀可抑制UUO大鼠肾组织Wnt/β-catenin信号途径的活化和转导，使肾间质细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)沉积减少，肾纤维化病变得到改善，但具体机制尚不明确。

本研究采用55mg/kg STZ多次腹腔注射成功复制I型糖尿病小鼠模型，生化及HE和Masson染色结果提示DN组及Ato组小鼠出现肾脏损害，继发DN，而Ato组小鼠经过阿托伐他汀治疗后，小鼠一般情况改善，尿素氮、24尿蛋白、甘油三酯、总胆固醇、肌酐均明显降低，病理形态观察可见间质炎性浸润细胞明显减少，PAS染色阳性物质减少，纤维化病变减轻，说明阿托伐他汀对DN小鼠肾具有一定的保护作用。β-catenin是经典Wnt通路的核心分子，其在胞浆中积聚增多后转移入核是经典Wnt信号通路活化的标志[15-16]。本实验免疫组织化学和Western blot结果显示DN组小鼠肾组织β-catenin表达较NC组明显增高，进一步证实了经典Wnt信号通路活化参与了DN肾纤维化发生，给予阿托伐他汀治疗后Ato组β-catenin表达较DN组明显减少，说明阿托伐他汀可抑制DN小鼠肾组织经典Wnt/β-catenin信号通路的活化。SFRPs是Wnt信号通路的拮抗因子，其家族成员包括SFRP1-5，其中SFRP1高表达于肾脏[17-20]。本实验研究发现DN小鼠肾组织SFRP1 mRNA和蛋白表达明显低于NC组小鼠，提示DN发生时Wnt/β-catenin经典信号通路的活化可能与该通路抑制因子SFRP1表达下调，进而对该通路抑制作用减弱有关。经阿托伐他汀治疗后，与DN组相比Ato组小鼠肾组织SFRP1 mRNA和蛋白表达增多，Wnt4、β-catenin、α-SMA和collagen-IV蛋白表达下调，E-cadherin蛋白表达上调，提示阿托伐他汀可能是通过上调SFRP1的表达而增强了对Wnt4/β-catenin信号通路的抑制作用，故阿托伐他汀干预后Wnt4/β-catenin信号通路相关分子表达明显下调，进而使其下游信号分子间充质细胞标志物α-SMA和collagen-IV表达减少，上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达上调，延缓DN小鼠EMT的发生和减少ECM沉积，起到了延缓DN小鼠肾纤维化的作用。与段兴旺等[21]在大鼠UUO肾纤维化模型中发现益肾康胶囊可能通过上调SFRP1表达而下调了β-catenin蛋白的表达，从而延缓肾纤维化进程的实验结果一致。

综上所述，在DN小鼠肾纤维化进程中，SFRP1 mRNA和蛋白水平的下调可能是导致wnt4/β-catenin信号通路异常活化的原因，而阿托伐他汀可以通过上调DN小鼠肾组织SFRP1 mRNA和蛋白的表达，进而抑制wnt4/β-catenin信号通路活化，延缓DN小鼠肾纤维化的发生发展。