UPLC-MS/MS快速测定烟草中2,4-滴和2,4,5-涕

杨 飞，刘珊珊，邓惠敏，边照阳，李中皓，范子彦，王 颖，唐纲岭

国家烟草质量监督检验中心，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

2,4-滴和2,4,5-涕是氯代苯氧羧酸类除草剂，广泛施用于禾谷类作物田、针叶树林和牧草场等，由于其价格低廉、除草速度较快、除草谱较宽等优点，在生产中一直发挥重要的作用［1-2］。2,4-滴、2,4,5-涕均为低毒除草剂，通过植物叶面、茎秆和根系吸收传导，阻碍植物激素的正常传导，从而导致其死亡。但在使用过程中，研究人员发现此类物质可以引起人类软组织恶性肿瘤，并且对动物体具有胎盘毒性。该类化合物因具有较高的水溶性和迁移性，在烟草生长过程中会被吸收并保留在烟叶中，从而对吸烟者的健康构成威胁［3-4］。2016年，国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）农用化学品咨询委员会（ACAC）制定了106种农用化学品指导性残留限量（GRL）清单，将烟草中2,4-滴和2,4,5-涕的残留量上限分别定为0.20和0.05 mg/kg。

2,4-滴和2,4,5-涕可以通过毛细管电泳［5］、液相色谱-紫外检测器［6-7］、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）［8-12］、气相色谱（GC）［13-14］、气相色谱-质谱联用（GC-MS）［15-21］多种方法检测。由于该类农药难以气化，采用GC、GC-MS方法分析时，必须先将该类农药用重氮甲烷、五氟苄基溴或三甲基硅烷衍生化为易气化的物质。衍生化后，方法的灵敏度得以大幅提高，但重氮甲烷和三甲基硅烷等衍生化试剂具有较强毒性，而且衍生化过程操作繁琐，耗时较长。普通液相色谱由于灵敏度低，无法满足限量要求，因此应用相对较少。近年来，随着LC-MS/MS选择性、灵敏度以及抗基质干扰能力的提高，采用LC-MS/MS对各类农药进行分析的文献报道逐年增多［8,22-25］，其中Koesukwiwat等［8］、Yang 等［24］和 Liu 等［25］采 用 QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe）方法分别对稻米和烟草中的2,4-滴和2,4,5-涕进行了提取和LC-MS/MS直接测定，该方法无需衍生化，简化了样品前处理过程。但是采用QuEChERS方法时，基质中的极性和非极性共提取物容易对目标物造成干扰，影响定性和定量结果的准确性。因此，在烟草行业标准YC/T 181—2004《烟草及烟草制品 有机氯除草剂农药残留量的测定 气相色谱法》［21］的基础上进行方法改进，利用超高效液相色谱-串联质谱技术简化烟草中2,4-滴和2,4,5-涕的检测过程，旨在为不同类型烟草样品中2,4-滴和2,4,5-涕的快速测定提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

30个烟叶样品全部来自2017年度国家烟草专卖局农残普查分析样品，烤烟、白肋烟和香料烟各10个。空白烤烟、空白香料烟和空白白肋烟样品各1个。所有样品烘烤后粉碎，过2 mm（10目）筛后置于棕色玻璃瓶中，于4℃下保存。

2,4-滴和2,4,5-涕农药标准品（＞98.0%，德国Augsburg公司）；二氯甲烷、甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；盐酸（37%，体积分数，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；水为超纯水。

Waters TQS四极杆串联质谱仪［配备电喷雾电离源（ESI）］、Waters Acquity I Class超高效液相色谱仪、ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm,1.7 μm）（美国Waters公司）；VX200涡旋振荡仪（美国Labnet公司）；Turbo Vap氮吹仪（美国Biotage公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；AEl63电子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 空白基质提取液的制备

称取2.0 g空白烟叶样品于50 mL带盖离心管中，加入20 mL 0.5 mol/L盐酸水溶液和20 mL CH2Cl2，涡旋振荡15 min；移取下层有机相至储液瓶中备用，即为空白基质提取液。

1.2.2 基质匹配标准工作溶液的配制

分别称取25 mg 2,4,5-涕以及100 mg 2,4-滴农药标准品，于同一个100 mL容量瓶中用甲醇定容，制得2,4,5-涕质量浓度为250 μg/mL，2,4-滴质量浓度为1 000 μg/mL的一级混合标准储备液。

移取100 μL一级混合标准储备液于100 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到2,4,5-涕质量浓度为0.25 μg/mL，2,4-滴质量浓度为 1.0 μg/mL 的二级混合标准储备液。

分别移取二级混合标准储备液1 000、500、250、100、50 μL至5个5 mL容量瓶中，用烤烟的空白基质提取液稀释并定容，制得不同质量浓度的烤烟基质标准工作溶液。烤烟基质标准工作溶液中 2,4,5-涕的质量浓度分别为 50、25、12.5、5.0、2.5 ng/mL；2,4-滴的质量浓度为 200、100、50、20、10 ng/mL。

白肋烟和香料烟基质效应与烤烟不同，因此在实验中白肋烟和香料烟对应的标准工作溶液应分别用其空白基质提取液稀释。

1.2.3 样品的前处理

称取1.0 g粉碎后的样品于50 mL带盖离心管中，加入10 mL 0.5 mol/L盐酸水溶液和10 mL CH2Cl2，涡旋振荡15 min；移取1 mL下层有机相，氮吹近干后用1 mL甲醇复溶，进行UPLC⁃MS/MS检测。检测条件为：

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）柱；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；流速：0.2 mL/min；流动相：A相为甲醇，B相为0.1%（体积分数）甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0~5.0 min为 10%A~90%A，5.0~8.0 min为 90%A，8.0~8.1 min为90%A~10%A，8.1~10.0 min为10%A；质谱扫描方式：负离子扫描；离子源：电喷雾电离源（ESI）；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：450℃；脱溶剂气流量：800 L/h；锥孔气流量：150 L/h；停留时间：100 ms；毛细管电压：3.0 KV；采集模式：多反应监测（MRM）。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 流动相的选择

分别考察水、甲醇、乙腈及其不同比例混合物对2种苯氧羧酸类农药分离的影响。结果表明，甲醇和乙腈对2种农药的分离效果相近，考虑到乙腈的毒性较甲醇大，因此选用甲醇-水作为流动相。实验中同时考察了甲酸对2种农药电离效果的影响，结果表明，在流动相中加入体积分数为0.1%的甲酸后两种农药的信号明显降低，但是色谱峰形得到明显改善。原因是：2,4-滴和2,4,5-涕为酸性化合物，在酸性介质中其电离受到抑制，从而使方法的检出限降低。由于在流动相中加入少量有机酸可以使目标物在经过色谱柱时以分子形式存在，改善其在色谱柱上的保留情况，因此选择甲醇-水（0.1%甲酸）为流动相。采用优化后的梯度洗脱程序对2种农药进行分析，其选择离子色谱图如图1所示。可以看出，2种农药的分离效果较好。

图1 2,4-滴和2,4,5-涕的选择离子色谱图Fig.1 SIM chromatogram of 2,4⁃D and 2,4,5⁃T

2.1.2 质谱条件的确定

取200 ng/mL标准溶液，以蠕动注射进样方式在ESI+和ESI-模式下进行全扫描。结果显示，在负离子（ESI-）模式下，［M-H］-和［M-H+2］-丰度较高，因此选择［M-H］-为定量离子的母离子，［M-H+2］-为定性离子的母离子。以［M-H］-和［M-H+2］-为前体离子，进行产物离子扫描，选取丰度较强、信号稳定的碎片离子作为定性和定量离子。最后，优化毛细管电压、离子源温度、锥孔电压、碰撞电压等参数条件，使各个离子对的信号响应最高。优化确定的2种农药的质谱参数如表1所示。

表1 2,4-滴和2,4,5-涕的质谱参数①Tab.1 MS parameters for 2,4⁃D and 2,4,5⁃T

2.1.3 萃取溶剂及其体积的确定

针对苯氧羧酸类农药的极性和溶解度，选取不溶于水的二氯甲烷、甲苯和乙酸乙酯作为萃取溶剂。在加入10 mL盐酸水溶液提取后，分别加入10、20、30 mL的二氯甲烷、甲苯或乙酸乙酯进行萃取，萃取结果如表2所示。在3种有机溶剂中，当溶剂体积为10 mL时，甲苯的萃取效果与二氯甲烷接近，但甲苯对目标物色谱峰形影响较大，峰展宽现象较严重，且出现峰分裂现象；加入二氯甲烷后，样品谱图中目标物的峰形较好，且杂质峰较少。综上考虑，选择二氯甲烷作为萃取溶剂。

当1.0 g烤烟、白肋烟和香料烟样品中2种农药的含量（质量分数）为5倍GRL（指导性农药残留限量）值时，使用10 mL二氯甲烷的平均回收率均大于90%；进一步增加有机溶剂体积时，萃取效率基本不变，但检测灵敏度下降，因此选择二氯甲烷的体积为10 mL。

表2 萃取溶剂在不同萃取比例下的萃取效率Tab.2 Effects of extraction agents on recoveries of 2,4,5⁃T and 2,4⁃D at different volume ratios

2.1.4 HCl浓度的确定

HCl的浓度会影响到苯氧羧酸类农药的质子化效果，从而影响其提取效果。在1.0 g烤烟、白肋烟和香料烟样品中2种农药的含量为5倍GRL浓度水平上，分别比较了0.25、0.5、1.0 mol/L HCl水溶液对2种农药的提取效果。结果（图2）显示，用0.5和1.0 mol/L HCl水溶液提取时，平均回收率相当，但用1.0 mol/L HCl水溶液时样品提取液的颜色较深，基质干扰较大，因此选择0.5 mol/L HCl水溶液作为提取溶剂。

图2 HCl浓度对提取效率的影响Fig.2 Effect of HCl concentration on recovery

2.1.5 振荡时间的确定

振荡提取是液-液萃取分析的重要环节之一。在1.0 g烤烟、白肋烟和香料烟样品中2种农药的含量为5倍GRL浓度水平上，采用3种振荡萃取时间，即涡旋剧烈振荡5、15和30 min，比较振荡时间对回收率的影响。结果（图3）显示，振荡萃取5 min时平均回收率较低。为了提高检测效率，且不影响回收率，选择涡旋振荡15 min。

2.1.6 基质效应的考察

在样品提取过程中，提取液中的共提物会影响目标物的定性、定量分析结果，这种现象称之为基质效应。通常，通过配制基质标准工作溶液来解决基质效应问题。为了考察不同基质对各种除草剂响应的影响，分别用白肋烟、香料烟、烤烟的空白提取液配制50 ng/mL溶液，将其响应值与利用甲醇配制的同浓度溶液的响应值进行对比。各样品中目标物响应强度与标准溶液响应强度的比值如表3所示。可以看出，不同类型的烟草样品基质对2种目标物的响应信号均有不同程度的抑制作用。因此，为了避免基质效应给定量结果带来干扰，本实验中对于不同类型的烟草样品，采用其对应的空白基质提取液配制标准工作曲线。

图3 振荡时间对回收率的影响Fig.3 Effect of oscillation time on recovery

表3 不同类型烟草的基质效应Tab.3 Matrix effects of different types of tobacco samples

2.2 方法评价

2.2.1 标准曲线、检出限和定量限

以各农药定量离子对的色谱峰面积（Y，cps）为纵坐标，浓度（X，ng/mL）为横坐标作图，得到标准工作曲线。分别以3倍和10倍信噪比（S/N）确定检出限（LOD）和定量限（LOQ）。结果（表4）显示，2个目标物的线性关系良好，相关系数高于0.999，可以满足定量分析要求。

2.2.2 方法的回收率及精密度

通过加标样品的回收率实验验证该方法的重复性及精密度（RSD）。采用不同浓度水平（LOQ，GRL，5倍GRL）的加标样品进行回收率实验。每个浓度水平进行5次平行测定，计算样品中2种除草剂的回收率和RSD。结果（表5）显示，3种不同类型烟草样品的回收率分别为80.4%~94.6%、80.8%~92.6%和79.5%~94.4%，且RSD均小于6.0%。

表4 2,4-滴和2,4,5-涕的标准工作曲线、相关系数、检出限及定量限Tab.4 Standard working curves,correlation coefficients,LODs and LOQs of 2,4-D and 2,4,5-T

表5 不同烟叶中2,4-滴和2,4,5-涕的回收率和精密度（n=5）Tab.5 Recoveries and precisions of 2,4⁃D and 2,4,5⁃T in different tobaccos（n=5）

2.2.3 与现有方法的对比

烟草行业标准 YC/T 181—2004［21］采用三甲基氢氧化硫将苯氧羧酸类农药衍生化为相应的甲酯，然后进行GC-MS检测。采用本方法对烤烟、白肋烟和香料烟样品各10个进行检测，结果显示，仅4个样品中检出2,4-滴或2,4,5-涕，其余样品均未检出2种目标物。采用本方法与标准方法对4个含有目标物的烟草样品进行检测和对比分析，结果（表6）显示，本方法检测结果与标准方法检测结果之间无明显差异，说明两种方法的一致性良好。

表6 不同方法的测定结果对比①Tab.6 Comparison of testing results of different methods（mg·kg-1）

2.2.4 能力验证实验

采取盲样测试的方式进行FAPAS（Food Analysis Performance Assessment Scheme）国际能力验证实验。各实验室按照自建方法对样品进行定性和定量分析。在2018年FAPAS国际能力验证实验中，采用本方法对样品进行定性和定量分析。样品为白肋烟，2,4-滴的设计值是0.50 mg/kg。各实验室结果如表7所示。本实验室检测结果为0.59 mg/kg，Z值为1.0，说明检测能力令人满意。

表7 能力验证实验结果Tab.7 Results of capability verification experiment

3 结论

通过优化质谱条件、色谱条件及样品前处理过程等，建立了快速测定烟草中2,4-滴和2,4,5-涕两种氯代苯氧羧酸类除草剂的UPLC-MS/MS方法。在本实验条件下，2,4-滴和2,4,5-涕的回收率在79.5%~94.6%之间，RSD在3.8%~5.9%之间，与烟草行业标准方法相比，结果无明显差异。FAPAS国际能力验证实验结果表明，本方法可用于盲样的准确定性定量分析。本方法以空白基质配制标准工作溶液，前处理简单快速，定量结果准确可靠，适用于烟草中该类农药残留的分析。