电针足三里-环跳穴对不同状态大鼠血清外泌体表达的影响*

李牧洋，王婷婷，2,陈 波△,李柠岑,卓雪茂,邢立莹,陈泽林

1.天津中医药大学(天津301617)；2.辽宁省大连市妇幼保健院(大连 116033)

外泌体(Exosomes)是一种由细胞内多囊泡体(Multivesicular body，MVB)与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的脂质双分子膜包裹的小囊泡，最早发现于体外培养的绵阳红细胞上清液中[1]，随后，在血液[2]、尿液[3]、乳汁[4]、羊水[5]中陆续被发现。外泌体可携带蛋白质、脂质、mRNA及microRNA等大量细胞内生物信息，是生物体细胞间通讯的重要方式，是神经、内分泌、免疫不同细胞及系统之间信息交互的重要载体[6]。 “信息传递新方式——细胞囊泡运输”的发现2013年被授予诺贝尔生理学或医学奖，使得囊泡研究成为医学及生命科学研究的热点。

最新研究表明，过往发现的与针刺镇痛密切相关的内源性活性物质也存在Exosomes运输形式。如Schuler等[7]人发现外泌体可作为阿片受体(MOR) siRNA的载体，透过血脑屏障治疗吗啡成瘾。Arslan等[8]人发现间充质干细胞来源的Exosomes可以释放ATP，减弱氧化应激，激活PI3K/Akt通路起到心肌保护作用。Clayton等[9]人发现外泌体所含酶的活性决定了细胞外腺苷的含量，外泌体是腺苷转运的重要方式。以上实验都提示，与针刺镇痛密切相关的诸多活性物质可能存在共通的运输载体——Exosomes。本实验探讨针刺对不同状态(正常、佐剂性关节炎)大鼠血清中外泌体表达的影响。

材料与方法

1 材 料

1.1 实验动物:实验选用清洁级雄性健康Wistar大鼠60只，体重(220±10)g，购自中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所实验动物中心[许可证号：SCXK(军)2014-0001]。

1.2 主要仪器与试剂:全自动凝胶成像仪(美国BIORAD公司)，化学发光酶标仪(美国Thermo Scientific公司)，0.22μm一次性滤膜(PALL，美国)，ExoQuick Precipitation试剂盒(美国SBI公司)，BCA蛋白定量试剂盒(武汉博士德公司)，鼠抗人CD63一抗(Abcam，英国)，羊抗鼠二抗(Affinity，中国)，CD63试剂盒(美国SBI公司)。

2 方 法

2.1 动物分组:针刺正常大鼠，将大鼠分为空白对照组(Control组)、正常+电针1 d组(EA1day)、正常+电针5 d组(EA5day)，每组4只，共12只。

针刺模型大鼠，将大鼠分为盐水组、模型、模型针刺组，每个时间点每组4只，共48只。

2.2 模型制备:将正常Wistar大鼠右后足足底注射完全弗式佐剂0.1 ml/只复制大鼠佐剂性关节炎动物模型。

2.3 干预方法:正常+电针组是在正常大鼠基础上单纯给予足三里-环跳穴电针刺激分别为1 d和5 d。给予模型针刺组1 d、5 d、10 d、20 d四个不同时间点的治疗，盐水组大鼠则于右后足同部位注射等量生理盐水。

2.4 针刺操作:取双侧足三里穴(腓骨小头前下5 mm处)、环跳穴(股骨大转子和最后骶椎连线的外1/3处)，采用华佗牌一次性不锈钢针灸针(0.25×13 mm)。进针并后连接华佗牌SDZ-V型电子针疗仪(上海寰熙医疗器械有限公司)刺激双侧穴位，足三里穴接正极，环跳穴接负极。参数为：疏密波，频率2/10Hz，强度5/10/15(0.76/1.53/2.3 mA)，各10 min，共30 min。

2.5 外泌体提取:正常+电针组于针刺后取腹主动脉血液，离心取血清(4℃，2000 g×10 min)。盐水组、模型、模型针刺组在造模/盐水注射后1 d、5 d、10 d、20 d分别取大鼠腹主动脉血，静置2 h后置于离心机上，4℃，2000 g×10 min，提取上层血清约2 ml，分装于EP管中，每管500 μl，于-80℃冰箱中保存备用。

从-80℃冰箱中取出血清500 μl，以3000×g，4℃，离心15 min，弃沉淀，保留上清；将上清液过0.22 μm一次性滤器，收集滤液，约300 μl。参照实验说明书，加入沉淀剂(ExoQuick Precipitation)，血清∶沉淀剂=4∶1，盖紧管盖，颠倒混匀3次。置于4℃冰箱过夜反应，至少12 h，将孵育好的样品以1500×g，4℃，再次离心30 min，去除上清后留取沉淀，此时的沉淀即为Exosomes小颗粒(含有部分细胞碎片)，将沉淀用100 μl 1×PBS重悬。

2.6 Western blot检测外泌体特异性标志蛋白:SDS-PAGE凝胶电泳及图像分析：将提取的外泌体加入1/4体积的RIPA蛋白裂解液，使用BCA法测定蛋白浓度。根据BCA蛋白定量结果调整蛋白浓度，加入5×loading buffer，97 ℃煮沸5 min，上样。4%浓缩胶低电压80V电泳30 min，随后转120V电压，电泳80 min，室温下以0.25%考马斯亮蓝染液染色2 h，烤染脱色液脱色2 h，Bio-Rad凝胶成像仪扫描并分析图像。

Western blot检测外泌体表面CD63：如前所述进行SDS-PAGE凝胶电泳，蛋白分离后将其转移至PVDF膜。以5% BCA(1×TBST，含0.05%Tween-20)室温封闭2 h。室温避光加入一抗(孵育鼠抗人CD63抗体，1∶2500)，4℃过夜。1×TBST洗膜后(5 min×6)，室温避光加入二抗(HRP标记的羊抗鼠IgG1∶5000)，室温孵育1 h，洗膜，滴加预混化学发光底物于PVDF膜，暗室曝光。

2.7 统计学方法：应用SPSS 16.0统计软件进行实验数据的统计学处理,多组(≥3)数据进行比较。使用LSD检验法，正态分布的各项统计指标均以均数±标准差表示,P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

1 电针对正常大鼠血清外泌体表达水平的影响 对正常大鼠持续电针发现：针刺1 d后，血清中外泌体水平显著升高。针刺5 d后，外泌体继续升高，说明电针可能促进了正常大鼠血清外泌体释放(图1)。

图1 电针正常大鼠足三里-环跳穴对血清exosome表达的影响

2 电针对CFA大鼠血清外泌体表达水平的影响 造模后(急性炎性状态下)，大鼠血清中外泌体较盐水组升高，针刺1 d后，外泌体降低。针刺5 d后，模型组与电针组仍高于对照组，电针组略高于模型组。针刺10 d后，大鼠踝关节局部转为慢性炎症，模型组与电针组血清中外泌体较对照组降低，且二者比较无统计学差异。针刺20 d后，模型组与电针组仍低于对照组，但电针组明显高于模型组，且接近于对照组。CFA致炎后，炎症急性发展期，大鼠血清中与炎症密切关联的外泌体可能大量释放，电针在此过程中可能抑制在炎症初期与病理模型密切相关的外泌体的释放。在炎症后期，电针所致的良性炎症反应可能释放与电针抗炎相关的外泌体，以抑制模型炎症过程(图2)。

图2 电针佐剂性关节炎大鼠足三里-环跳穴对血清外泌体表达的影响

讨 论

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以侵蚀性关节炎为主要临床表现的自身免疫病,基本病理表现为滑膜炎、血管翳形成,并逐渐出现关节软骨和骨破坏,最终导致关节畸形和功能丧失,可并发肺部疾病、心血管疾病、恶性肿瘤及抑郁症等[10-11]历代文献研究发现，类风湿性关节炎属于中医“骨痹”范畴，或成为“膝痹”，其致病之本为肝、脾、肾亏虚，加之外感风寒湿邪，气血瘀滞，痰湿阻络，不通则痛，发为本病。

本研究选取足三里穴和环跳穴予以相应治疗，足三里为强身健体之要穴，具有调理脾胃、通经活络、补中益气、扶正祛邪的作用。针刺足三里补益气血，可有效延缓膝关节炎的症状加重。《灵枢》：“着痹不去，久寒不已，卒取其三里骨为干。”强调足三里对着痹，即关节炎类疾病有独特疗效。《针灸甲乙经》：“胫痛不可屈伸，痹不仁，环跳主之。”《席弘赋》：“冷风冷痹疾难愈，环跳腰间针与烧。”说明针灸对痹症所致的麻痹不仁、缠绵难愈具有一定作用[12]。

本研究以外泌体特有的标记蛋白 CD63为标志物进行检测，发现电针可促进正常大鼠血清外泌体释放，且在D1-D5范围内，外泌体表达随着针刺次数增加而升高；在佐剂性关节炎炎症急性发展期，电针可抑制与炎症密切相关的外泌体释放，在炎症后期，电针刺激可能释放与电针抗炎有关的外泌体，起到抑制炎症的作用[13-15]。

外泌体是所有细胞分泌的纳米级微囊泡，细胞间通讯的重要方式，是神经-内分泌-免疫网络调节的重要载体，过往发现的与针刺镇痛密切相关的内源性活性分子也以外泌体方式传递信息。电针激活神经系统在健康或者是疼痛的情况下是各不相同的，并且可以同时减轻痛感觉和痛反应。在生理状态下，持续电针大鼠发现：针刺1 d后，血清中外泌体水平升高显著。针刺5 d后，外泌体继续升高，说明电针能有促进正常大鼠血清外泌体释放的趋势。在此过程中，外泌体中携带的活性镇痛物质(如阿片肽、ADO、5-HT、SP等)可能参与了大鼠足底热辐射痛的镇痛效应。在病理状态下，造模后，大鼠血清中外泌体较盐水组升高显著，针刺1 d后，外泌体降低。针刺5 d后，电针组持续升高。针刺10 d后，大鼠踝关节局部转为慢性炎症，模型组与电针组血清中外泌体较对照组降低，且二者无显著差异。针刺20 d后，电针组明显高于模型组，且接近于盐水组。由此猜测，CFA致炎后，炎症急性发展期，大鼠血清中与炎症密切关联的外泌体可能大量释放，电针在此过程中可能抑制在炎症初期与病理模型密切相关的外泌体的释放。在炎症后期，电针所致的良性炎症反应可能释放与电针抗炎相关的外泌体，以抑制模型炎症过程。

以往大量研究表明，电针的启效机制是通过神经-内分泌-免疫网络调节模式来达到镇痛、抗炎效应，而外泌体是神经、内分泌、免疫系统细胞间通讯的重要方式，与炎症相关的多种生物分子，如CGRP、NE、IL、TNF-α等化学物质，这些信号分子可以将针刺信息级联放大， 激活人体神经-内分泌-免疫网络系统发挥针刺网络调节效应[16-17]，故推测外泌体携带多种特定的信息进行体内长距离的运输，其内含物质在针刺传导的网络调节中可能发挥重要作用[18-19]。外泌体内含物质作为供体和受体细胞生理调节物，参与神经系统发育和功能的许多方面，包括突触沟通、调节突触的强度、神经再生、神经退行性疾病、脑肿瘤进展等[20]。 同时， 外泌体还可以通过细胞间物质的运输和交换进行内分泌及免疫反应的诱导、 扩增和/或调节[21]， 如中性粒细胞衍生的胞外囊泡的定向运输使血小板介导先天免疫反应等[22],针刺的网络调节是复杂的，而这种复杂网络之中相互关联的关键物质启效时间必然存在差异。我们前期研究发现相比于电针镇痛效应，抗炎效应出现较晚且较为持久，这可能与外泌体携带的信息物质有关。为了维持机体内稳态平衡，抑制炎症早期出现的疼痛反应，外泌体携带的信息以“镇痛”为主要目标，随着炎症发展，镇痛已不能满足机体自身对于稳态失衡的调节，继而以“抗炎”为主要任务。