复方红豆杉胶囊对Walker-256移植性肝癌大鼠HIF-1α、VEGF及PCNA表达的影响*

张 琳,高 勇

陕西省宝鸡市妇幼保健院(宝鸡 721000)

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，具有治疗难度大、发病率高及死亡率高等特点。诸多研究结果表明，中医药对于肝癌等各种类型癌症的治疗具有确切的临床疗效[1-2]。复方红豆杉胶囊是临床常用的抗肿瘤中药制剂，具有活血祛瘀、消肿散结等功效，主要用于非小细胞肺癌的辅助治疗[3]。有研究结果表明，复方红豆杉胶囊用于治疗肝癌亦具有较好的疗效，但该结论仍缺乏动物实验及大样本临床观察结果予以深入阐述，而对于药物作用机制亦未进行研究[4]。为此，本研究观察了复方红豆杉胶囊对Walker-256移植性肝癌大鼠肝组织中缺氧诱导因子(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)及增殖细胞核抗原(PCNA)等肿瘤缺氧微环境中主要细胞因子表达的影响，期望为复方红豆杉胶囊用于肝癌的治疗提供一定的实验依据，现报道如下。

材料与方法

1 动 物 清洁级SD雄性大鼠50只，体质量180～220 g，另取清洁级断奶SD雄性大鼠10只用于肝癌细胞的增殖传代，体质量60～80 g，每周进行1次传代，形成癌性腹水后制作肿瘤细胞悬液，用于移植性肝癌造模。所有大鼠均购于陕西省疾控中心实验动物中心，并由该中心代饲养，动物生产合格证号: SCXK(陕)2017-0002。

2 实验瘤株 本研究所用Walker-256癌肉瘤，购买自中国典型培养物保藏中心，并保存在陕西省疾控中心药品评价中心-80℃冰箱。

3 仪器与试剂 Olympus 21型显微照相系统(日本奥林匹斯公司)；BBS-DC型超净化工作台(上海安赛医疗器械有限公司)；AS-SA1型全自动血液分析仪(北京博大医用器械公司)；5417R型冷冻离心机(德国Eppendorf实验仪器公司)；NB-9型全自动多功能酶标仪(美国天地公司)。兔抗HIF-1α、VEGF及PCNA抗体及检测所需试剂盒(南京建成生物制品研究所)；苏木素-伊红溶液(美国sigma公司)；PBS磷酸盐缓冲液(陕西安义生物制品有限公司)；复方红豆杉胶囊(重庆赛诺生物药业股份有限公司)。

4 分组、给药及造模方法 将上述50只清洁级SD雄性大鼠随机分为空白组、模型组、小剂量复方红豆杉胶囊处理组、中剂量复方红豆杉胶囊处理组和大剂量复方红豆杉胶囊处理组，每组均为10只。依据文献报道[5]，确定各组大鼠的给药剂量，即大鼠给药剂量(mg/kg)=成人剂量(mg/kg)×6.25，成人体质量用60 kg计，复方红豆杉胶囊的一般人体剂量为1.8 g/60 kg=0.03 g/kg，折合大鼠剂量则为0.03×6.25=0.1875 g/kg，故分别选取0.93 g/kg，0.1875 g/kg及0.37 g/kg为小剂量组、中剂量组及大剂量组的给药剂量。

根据文献方法[6]，对各组大鼠进行肝癌模型造模：抽取5 ml二次传代后的幼鼠癌性腹水，以高速离心机(1200 r /min；5 min)离心后弃去上清液，用生理盐水洗涤下层瘤细胞1次，洗涤结束后以PBS溶液制备瘤细胞悬液备用。实验用SD大鼠术前禁食禁水12 h，以40 mg /kg 剂量的2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉成功后均取仰卧位固定并采用碘酒消毒，沿腹白线自大鼠剑突下逐层切开约1.5 cm，暴露大鼠腹腔并托出肝左外叶，用0.25 ml 注射器抽取瘤细胞悬液0.05 ml(细胞计数约5×106个)，将针头与肝脏表面呈30°角斜刺入除空白组外其余组大鼠肝左外叶约0.8 cm，将瘤细胞悬液缓慢注入，快速拔针并采用凝胶止血海绵填塞穿刺点15 s，无活动性出血后将肝脏还纳于腹腔并缝合腹部伤口，空白组则注入等量生理盐水，其余操作均与各组一致。术后肌肉注射青霉素[10 万U/(只·d)]，连续注射3 d。于造模第7天，从各组分别随机抽取2只大鼠处死并取肝脏，病理组织学检查结果证实空白组肝脏均正常，而其余组则均成功造模，故本研究各组大鼠有效例数均为8例。于造模第8天开始，对低、中及高剂量组大鼠灌胃给予相应剂量的复方红豆杉胶囊，采用生理盐水进行溶解并配制为密度1.30g/ml的浸膏，1次/d，连续给药21 d，空白组及模型组则仅给予等量生理盐水。

5 标本处理及检测方法 于末次给药24 h后，采用乙醚将大鼠麻醉，以腹主动脉取血法取5 ml血，以高速离心机(1200 r /min；5 min)分离血清，检测其中肝功能指标水平，主要包括天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)、白蛋白(ALB)及丙氨酸氨基转移酶(ALT)。采取颈椎脱臼法将各组大鼠处死，解剖取肝脏癌组织(存在多个癌结节的取最大)，空白组则取针头刺入部位肝组织，将其平均分为4部分，用10%甲醛溶液将其中1份固定，并进行脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋及切片处理，采用苏木精-伊红染色法进行常规组织学观察。其余三部分则采用常规脱蜡，以SP法检测，抗HIF-1α、VEGF及PCNA抗体的工作浓度依次为1∶200、1∶300和1∶500，上述蛋白阳性表达依次为胞质呈黄色颗粒、黄色细胞核染色及胞质呈蓝色颗粒，应用Image-proplus 6.0软件对上述蛋白阳性表达进行半定量分析，并统计其相对表达量。

结果

1 各组大鼠肝功能比较 见表1。与模型组相比较，空白组、小剂量、中剂量和大剂量复方红豆杉胶囊处理组大鼠血清ALB含量明显增高，而AST、TBIL及ALT含量则均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。与空白组相比较，小剂量、中剂量和大剂量复方红豆杉胶囊处理组大鼠血清ALB含量降低，而AST、TBIL及ALT含量则均明显增高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠肝功能比较

注：与空白组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05

2 各组大鼠肝脏病理学比较 光镜下显示，正常组肝组织结构正常，小叶边界清晰，被膜无增厚，肝叶实质细胞无坏死及变性，无淋巴细胞浸润，肝板以小叶中央静脉为中心放射排列，中央静脉壁无增厚，未见结缔组织增生，间质细胞不增多且门管区三管清晰可见。模型组则出现肝癌细胞呈团块状及梁索状排列并向周围组织浸润，区域肝细胞大量非典型性增生，周围组织肝细胞呈现点状坏死及弥漫性水肿变形，结缔组织明显增生，肝小叶结构被破坏且汇管区出现大量炎性细胞浸润。小剂量、中剂量和大剂量复方红豆杉胶囊处理组大鼠肝癌细胞排列紊乱，结缔组织异常增生及胞核肿胀增大等现象较模型组均得到了明显改善，尤其以高剂量组中最为显著(图1)。

A：空白组；B：模型组；C：小剂量组；D：中剂量组；E：高剂量组

3 各组大鼠肝脏HIF-1α、VEGF及PCNA表达比较 见表2。空白组肝脏中HIF-1α、VEGF及PCNA仅偶见阳性表达细胞，模型组肝脏中上述蛋白均呈强阳性表达，而小剂量、中剂量和大剂量复方红豆杉胶囊处理组肝脏中HIF-1α、VEGF及PCNA阳性表达细胞数均显著弱于模型组。Image-proplus 6.0软件的半定量分析结果表明，与模型组比，空白组、小剂量、中剂量和大剂量复方红豆杉胶囊处理组大鼠肝脏HIF-1α、VEGF及PCNA的相对表达量均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与空白组比，小剂量、中剂量和大剂量复方红豆杉胶囊处理组上述蛋白相对表达量均明显增高，差异有统计学意义(图2～4)。

A：空白组；B：模型组；C：小剂量组；D：中剂量组；E：高剂量组

A：空白组；B：模型组；C：小剂量组；D：中剂量组；E：高剂量组

A：空白组；B：模型组；C：小剂量组；D：中剂量组；E：高剂量组

组 别nHIF-1αVEGFPCNA空白组81.00±0.00*1.00±0.00*1.00±0.00*模型组824.56±2.45#35.31±3.56#27.34±2.13#小剂量组818.31±1.87#19.23±1.98#21.33±2.08#中剂量组815.24±1.46*#16.24±1.68*#16.34±1.31*#大剂量组89.21±0.86*#8.45±0.92*#7.31±0.73*#

注：与对照组比较，#P<0.05；与模型组比较，*P<0.05

讨论

肝癌的转移与复发是造成患者死亡的最重要原因之一，以往临床对于肝癌转移与复发的研究多集中于肿瘤组织与癌细胞自身，而目前对肿瘤组织与细胞的微环境研究则已发展成为抗肿瘤研究的新方向[7-8]。肿瘤微环境是肿瘤细胞发展、侵袭及转移的重要场所，而HIF-1α、VEGF及PCNA等细胞因子在上述过程中均扮演着重要角色，上述蛋白可通过复杂的信息传导通路为肿瘤组织提供适合发展的外部环境，不断促进肿瘤的侵袭及转移[9]。其中HIF-1α是人体中唯一的在肿瘤细胞特异性缺氧状态时发挥活性的一种转录因子，可有效促进肿瘤细胞对缺氧微环境的适应作用，参与肿瘤新生血管的生成，并促进癌细胞增殖、浸润及转移，在肿瘤的发展过程中起到关键作用[10-11]。VEGF则是机体中最重要且最直接的促血管生成因子之一，可直接促进肿瘤新生血管的生成作用，其合成量与HIF-1α水平的变化情况成正比，具有显著的相关性[12-13]。PCNA则能够有效促进肿瘤细胞的大量增殖，并参与多种类型肿瘤组织的浸润与转移，其表达量可直接反映肿瘤细胞增殖及分化作用，在缺氧状态下，该蛋白还可有效促进HIF-1α的合成与分泌，间接的促进肿瘤病灶血管生成作用[14-15]。由此可见，通过观察HIF-1α、VEGF及PCNA等肿瘤微环境细胞因子的变化情况来监测肿瘤病灶的动态，对于癌症的治疗具有重要意义。

复方红豆杉胶囊是临床常用于治疗非小细胞癌的现代化中药制剂，主要由红豆杉、红参与甘草等多种药材所组成，具有活血祛瘀、消肿散结等功效，方中红豆杉可消积、活血祛瘀、消肿散结及解毒；红参则可扶正固本；甘草调和诸药[16-17]。现代药学研究结果表明，复方红豆杉胶囊中含有的红豆杉总生物碱可有效阻滞机体HIF-1α的合成与释放，从而抑制肿瘤的浸润与侵袭；甘草次酸则可具有较强的保肝活性，可改善肝癌所导致的肝损伤；红参水提取物则能够抑制VEGF的合成，从而降低肿瘤新生血管的生成作用[18-20]。目前，临床对于复方红豆杉胶囊用于非小细胞癌的治疗具有一定的研究基础，而少数临床观察结果亦显示该药物治疗肝癌亦具有较好的疗效，但对于复方红豆杉胶囊用于肝癌的治疗机制与动物实验研究则涉及较少。鉴于该药物具有较好的抗肝癌及抗肿瘤微环境细胞因子的物质基础，笔者采用Walker-256移植性肝癌大鼠模型对复方红豆杉胶囊抗肝癌活性及其对HIF-1α、VEGF及PCNA等肿瘤微环境细胞因子的表达的影响进行了观察，期望为该药物的应用及肝癌的治疗药物选择提供一定的实验依据。

综上所述，复方红豆杉胶囊可通过降低Walker-256移植性肝癌大鼠模型HIF-1α、VEGF及PCNA的表达，从而达到抑制肿瘤增长、降低癌细胞对肝细胞的损伤的目的，对复方红豆杉胶囊用于肝癌的治疗提供了较好参考价值。