miR-335在子宫内膜癌患者血清中的表达及检测临床意义

冯苗苗,曹秋雨

广州中医药大学第一附属医院妇科(广州 510405)

子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，好发于围绝经期和绝经后女性[1]。在我国，子宫内膜癌的发病率呈逐年上升的趋势，目前仅次于宫颈癌，居女性生殖系统恶性肿瘤的第二位，严重威胁患者的生命健康[2]。一般认为，子宫内膜癌按发病机制和生物学行为特点可分为雌激素依赖型(I型)和非雌激素依赖型(II型)[3]，但有关子宫内膜癌的确切发病机制迄今尚不清楚，故临床尚无有效的预防策略，仍将重点应放在早期发现和早期治疗上。miRNA是一类长度为18～24个核苷酸的内源性小RNA[4]，近年来的研究表明，miRNA参与细胞代谢、增殖、分化及凋亡等的调控，并与肿瘤的发生发展密切相关[5]。最近的研究发现，miR-335在多种生殖系统恶性肿瘤，如卵巢癌、宫颈癌及前列腺癌等中发挥重要作用[6]，因此，本研究旨在进一步探讨miR-335在子宫内膜癌患者血清中的表达及其临床意义，现报道如下。

资料与方法

1 一般资料 选取2017年8月至2018年4月我院收治的78例子宫内膜癌患者和70例健康妇女作为研究对象，其中子宫内膜癌组：年龄为41～73岁，平均年龄(52.6±7.3)岁，病理类型：子宫内膜样癌62例，非子宫内膜样癌16例，临床分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期29例，Ⅲ期31例，Ⅳ期6例，患者均经组织病理学检查确诊为原发性子宫内膜癌，且均为初发病例，术前未接受放化疗治疗。正常对照组：年龄为39～71岁，平均年龄(51.3±6.5)岁，两组患者的年龄等基本资料相比无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，且研究对象均知情同意并签署了知情同意书。

2 研究方法

2.1 仪器和试剂：荧光定量PCR测定仪、紫外分光光度计均购自Thermo Fisher公司；血清RNA提取试剂盒、逆转录酶试剂盒购自Invitrogen公司；miR-335引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Bulge-Loop miRNA qRT-PCR检测试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司。

2.2 样本收集：收集两组的肘部外周静脉血样本3 ml，室温静置2～3 h，待血液完全凝固后，3000 r/min，4℃，离心10 min，将上层血清转移至无RNA酶的EP管中，-80℃冰箱保存待检。

2.3 RT-PCR：①取血清400 μl，严格按照血清RNA提取试剂盒说明书提取血清总RNA，应用紫外分光光度计检测RNA的纯度及浓度。②逆转录反应：严格按照逆转录试剂盒操作说明书进行操作，反应体系为20 μl，冰上依次加入以下试剂：总RNA 1 μl、10×RT buffer 1.5 μl、1 μmol/L逆转录特异性引物3 μl、50 U/μl MultiScribeTMReverse Transcriptase 1.0 μl、20 U/μl RNA酶抑制剂0.19 μl、100 mmol/L dNTPs 0.15 μl,加DEPC水补至20 μl。反应条件：37℃ 60 min，95℃ 5 min，产物置于-20℃保存。③实时荧光定量PCR：严格按照PCR试剂盒操作说明书进行PCR扩增。反应体系为20 μl，冰上依次加入以下试剂：逆转录产物cDNA 1 μl、引物1 μl、TaqMan GEx MASTER Mix 10 μl，加双蒸水补至20 μl。反应条件：95℃反应20 s，95℃反应10 s，60℃反应20 s，共40个循环。④采用ΔCt值法对PCR结果进行分析，ΔCt值= Ct值(miR-320)- Ct值(内参基因)。

结 果

1 两组血清miR-335相对表达量比较 子宫内膜癌组患者血清miR-335的相对表达量 (0.96±0.25)明显低于正常对照组(1.92±0.57)(图1),两组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。

注：与正常对照组相比，**P<0.05

2 子宫内膜癌患者血清miR-335相对表达量与其临床病理特征的相关性分析 子宫内膜癌患者血清miR-335相对表达量与TNM分期、组织病理类型和淋巴结转移密切相关(P<0.05)，而与患者的年龄、是否绝经、组织病理分级及CA125值无明显相关性(P>0.05)，见表1。

3 ROC曲线分析 采用ROC曲线评价血清miR-335在子宫内膜癌中的诊断效能，其曲线下面积为0.793(95%CI：0.526～0.975)，诊断敏感性为89.43%，特异性为76.52%(图2)。

图2 血清miR-335对子宫内膜癌的诊断效能ROC曲线

讨 论

miRNA是一类长度为18～24个核苷酸的内源性小RNA，具有高度的保守性，可负调控基因的表达[7]。研究表明，miRNA参与细胞发育、代谢、增殖、分化及凋亡等多种生理病理过程的调控，并与肿瘤的发生发展密切相关[8]。近年来报道显示，血清中存在多种miRNA，其性质稳定，能耐受酸碱环境，不易被血液内源性或外源性RNases降解[9]，正常生理状态下，miRNA在机体内的表达遵守严格的组织、时序特异性[10]，但在病理状态下，miRNA可能发生异常表达[11]，因此，血清miRNA在肿瘤诊断中越来越受到重视。

表1 子宫内膜癌患者血清miR-335相对表达量与其临床病理特征的相关性

子宫内膜癌是最常见的女性生殖系统肿瘤之一，该病对女性的生命安全与健康构成了严重威胁，其发病原因主要与长期持续的雌激素刺激、子宫慢性炎症、月经紊乱及长期高脂肪饮食等因素有关[12-13]，然而，目前尚不清楚子宫内膜癌确切的发病机制。研究表明，子宫内膜癌中存在多种miRNA的异常表达，提示miRNA可能在子宫内膜癌的发生发展中发挥重要作用[14-15]。最近的研究发现，卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、肺癌、肝癌等肿瘤，尤其是在多种生殖系统恶性肿瘤中miR-335呈低表达，提示miR-335可能在一定程度上起着抑癌基因的作用[16-17]。然而，国内关于miR-335在子宫内膜癌中表达情况的报道较少，因此，本研究探讨了血清miR-335在子宫内膜癌中的表达及其临床意义。

本研究结果显示，子宫内膜癌组患者血清miR-335的相对表达量明显低于正常对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)，这提示miR-335低表达可能在某种程度上促进子宫内膜癌的发生发展，miR-335表达水平显著降低，可能是子宫内膜癌的一个重要生物标志物。进一步分析miR-335表达与子宫内膜癌临床病理特征相关性，结果发现，子宫内膜癌患者血清miR-335相对表达量与TNM分期、组织病理类型和淋巴结转移密切相关(P<0.05)，而与患者的年龄、是否绝经、组织病理分级及CA125值无明显相关性(P>0.05)，这提示血清miR-335表达不易受个体因素或其他因素影响，其对子宫内膜癌的组织病理类型、疾病进展及淋巴结转移判断具有一定的临床价值。由ROC曲线图可知，血清miR-335对子宫内膜癌的诊断敏感性和特异性均较高，以上研究结果提示，血清miR-335可能是子宫内膜癌早期诊断的潜在标志物和治疗新靶点，尤其可以弥补CA125等传统血清肿瘤标志物在早期诊断中的不足。

综上所述，miR-335在子宫内膜癌患者血清中呈低表达，且其表达水平与子宫内膜癌的发生发展密切相关，miR-335可能成为诊断子宫内膜癌的潜在标志物和治疗新靶点。存在的不足之处，本次研究纳入的样本量较少，今后应扩大样本量的收集，以进一步研究miR-335与子宫内膜癌发生发展的关系，以期为子宫内膜癌的临床诊治提供更有价值的参考依据。