外源性Apelin-13对重症急性胰腺炎大鼠治疗作用及其机制研究*

徐 博，苏军涛，钟 烨，崔明新，王长友，陈建立，王晓涛，田 炜，张国志△

1.华北理工大学附属医院普外科(唐山 063000);2.华北理工大学医学实验中心(唐山 063000)

重症急性胰腺炎(SAP)是一种由多种原因导致的炎症因子释放，致层级样改变引起的高发病率、高病死率的常见急腹症，SAP 病情迅猛，早期即可引发全身炎症反应综合征(SIRS)，SIRS多较难控制，从而进展为多脏器功能障碍综合征(MODS)[1-2]。Apelin是Tatemoto等1998年发现的一种血管活性肽，逆转录过程中可被蛋白水解酶分解为多个蛋白活性片段，其中Apelin-13是目前已知Apelin家族存在范围最广活性最强的片段[3]。Apelin-13被发现广泛存在于大脑、下丘脑、胃肠、心脏及血管中，且参与循环、消化、呼吸、神经内分泌等多种生物学功能[4]。但Apelin-13对于SAP的疗效及机制尚不明确。本实验通过外源性Apelin-13治疗SAP大鼠，观察外源性Apelin-13对SAP大鼠的疗效并探讨NO在其中作用机制。以求为外源性Apelin-13治疗SAP的临床应用提供理论支持。

材料与方法

1 材 料 ①实验动物及分组：取11～13周龄健康雄性Sprague Dawley大鼠60只(SPF级)，体重225～255 g，由华北理工大学动物实验中心提供。依据随机数表法随机分三组，分别为空白组、SAP组、治疗组，各20只。空白组：按照SAP组标准进行开腹，分离胃十二指肠，找到胰胆管，注射等量生理盐水。SAP组：按照SAP模型制备方式造模，给予等量生理盐水处理。治疗组：外源性Apelin-13治疗组大鼠，按照SAP组标准制备SAP大鼠，于造模后立即给予外源性Apelin-13 0.1 mg/kg大鼠阴茎背静脉注射。②试剂：牛黄胆酸钠、水合氯醛购于上海吉利生化公司，内参β-actin抗体等Western blot相关试剂均购自北京瑣来宝生物技术有限公司，Apelin-13购自Santa Cruz，AMS、NO、IL-6、TNF-αELISA试剂盒购分别购于自北京科达生物技术股份有限公司及R&D Systems，iNOS抗体、eNOS抗体购于上海酶奥森生物科技有限公司。

2 SAP动物模型建立 大鼠SAP模型制备：本实验动物模型的制作参考白槟等[5]的SAP模型，并进行部分改进，即造模前8 h给予SD大鼠禁食、造模前4 h禁水,术前准备完毕后用1 ml注射器抽取约0.75 ml 10%的水合氯醛腹腔注射麻醉(麻醉剂量依据0.3 ml/100g)。确认麻醉后,牵引大鼠四肢固定在操作台上,常规备皮、消毒、铺单，于大鼠剑突下约1横指处沿腹白线向下做一长约4～5 cm纵行切口，逐层打开大鼠腹腔，可见一中空透明的斜行管道起自十二指肠大乳头处，长约2～3 cm，此斜行管道即为大鼠胆总管。30 mm动脉夹将肝门部胆总管夹闭，以防5%牛黄胆酸钠溶液逆行进入肝脏及胆囊，助手以血管钳提起大鼠十二指肠，实验者在十二指肠大乳头孔处缓慢置入一次性静脉留置针(针头型号为25G)，穿刺进胰胆管，进针长度约10 mm(注意动作轻柔切勿损伤胰胆管)，拔出静脉留置针针芯，采用1 ml注射器缓慢匀速推注5%的牛磺胆酸钠溶液,肉眼可见胰腺组织均匀隆起，颜色及质地较造模前无明显改变，缓慢退出一次性静脉留置针，还纳大鼠胃十二指肠等组织回腹腔，逐层单纯间断缝合关腹，大鼠SAP模型制备完毕。注意实验过程中无菌操作及避免副损伤。

3 标本采集 各组SD大鼠均取3、6、12、24、48 h，各组5个时间点随机取出4只同法麻醉后，于原腹部切口向下做纵行延长切口开腹至显露下腔静脉位置。用一次性静脉采血针取下腔静脉血约4 ml，并分离取出胰腺组织。

4 生物化学指标测定 淀粉酶(AMS)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、一氧化氮(NO)等指标按照ELISA试剂盒说明书进行。

5 胰腺组织病理学检测 于-80 ℃冰箱取部分胰腺组织，置于-20 ℃冰箱4 h，福尔马林溶液固定6 h，水洗6 h，石蜡包埋、切片、脱蜡、HE染色、封片、电子显微镜阅片。

6 蛋白质表达检测 标准Western blot过程检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS) 蛋白表达情况。

结 果

1 各组大鼠组织病理学改变 肉眼下观察,各组胰腺大体改变：空白组大鼠胰腺随时间延长色泽及质地较造模前未出现明显变化，未见明显水肿、出血及坏死，胰腺组织与周围分界清晰。SAP组大鼠注射5%牛黄胆酸钠后，胰腺组织充血、水肿随时间改变不断加重，自12 h开始腹部出现大量血性腹水，周围各段肠管可见肿胀，伴刺鼻恶臭味，胰腺组织出现肉眼可见的出血及部分坏死，至24 h胰腺组织遍布坏死灶、胰腺边缘无法辨识。Apelin-13治疗组大鼠胰腺随时间变化光泽变暗,可见少量充血，至12 h可见随时间进展胰腺组织逐渐出现点状坏死灶，胰腺状态明显好于SAP组。HE染色200倍镜下观察，各组胰腺病理改变(图1)：空白组随时间变化胰腺病理切片未见显著病理学改变，各时间点胰腺小叶未见明显水肿及炎症细胞浸润、胰腺腺泡轮廓清晰可见。SAP组随时间进展胰腺间质及血管可见多量炎细胞，大片状出血、坏死灶明显，胰腺小叶大量炎细胞聚集，胰腺组织可见明显纤维性渗出，胰腺腺泡结构呈空泡样甚至消失。治疗组随时间延长胰腺小叶结构较完整，胰腺间质血管可见少量白细胞浸润，至12 h小部分腺泡结构消失，间质出现较多量炎症细胞浸润渗出，可减少量出血点及坏死灶。

图1 各组胰腺组织炎症严重程度对比图(HE染色，×200)

2 大鼠血清生化检验结果 大鼠血清生化检验结果见表1～4。ELISA结果提示：空白组大鼠造模后AMS、IL-6、TNF-α、NO等指标随时间延长无明显改变(P<0.05)。SAP组大鼠造模后AMS、IL-6、TNF-α、NO等指标明显高于空白组及治疗组(P<0.05)，且随时间变化仍逐渐增高。治疗组大鼠AMS、IL-6、TNF-α、NO随时间变化有逐渐增高趋势，且相同时间内治疗组各指标均高于空白组(P<0.05)，而低于SAP组(P<0.05)。可以看出在治疗组3 h NO浓度较SAP组并无明显改变，在此之后的时间内NO浓度水平增高，但和SAP组差距逐渐拉大，即治疗组NO浓度处于增高趋势，但远低于SAP组(P<0.05)。

表1 各组大鼠血清淀粉酶含量(U/L)

注：与SAP组相比，*P<0.05

表2 各组大鼠血清NO含量(μmol/L)

注：与SAP组相比，*P<0.05

表3 各组大鼠血清 IL-6含量(ng/ml)

注：与SAP组相比，*P<0.05

3 各组大鼠胰腺组织iNOS、eNOS表达情况 利用Western blot检测了各组大鼠iNOS、eNOS在处理后48 h的表达改变情况(图2～3)。iNOS的相对表达量在SAP组(0.884±0.154)和治疗组(0.215±0.057)中均高于空白对照组(0.101±0.053)，但治疗组中，iNOS的相对表达量较于SAP组明显受到抑制。eNOS的相对表达量在SAP组(0.153±0.044)和治疗组(0.386±0.071)均低于空白对照组(0.878±0.166)，但治疗组中，iNOS表达相较于SAP组明显受到抑制。

表4 各组大鼠血清TNF-α含量(ng/ml)

注：与SAP组相比，*P<0.05

图2 各组iNOS蛋白相对表达量

图3 各组 eNOS蛋白相对表达量

讨 论

研究SAP时发现，体内众多细胞因子和炎症介质呈现级联反应的特征，从而引起更为致命的SIRS和MODS是SAP最严重最常见的死因。在MODS疾病演变过程中，TNF-α、IL-6及NO等炎症因子扮演着举足轻重的角色。淀粉酶水平是临床最常用于诊断急性胰腺炎的生化指标，TNF-α、IL-6及NO水平是SAP的重要诊断指标和预后评价指标[6]，炎症介质水平与SAP损伤程度及预后联系紧密。

HE染色结果显示：空白组随时间变化未见明显病理学改变，SAP组、治疗组随造模时间延长，炎症损伤均呈逐渐加重趋势，但是SAP组大鼠相同时间内胰腺组织损伤程度远远重于治疗组。证明外源性Apelin-13对SAP治疗有效。

TNF-α与多种炎症反应的发生发展密切相关，且处于炎症反应的起始部位，多项数据表明SAP损伤程度及预后与TNF-α的浓度高低正相关[7]。TNF-α由体内被激活后的单核巨噬细胞产生，高浓度的活化TNF-α可启动“瀑布样”炎症反应，刺激炎症细胞产生多种组织损伤因子，引起胰腺出血、坏死，受损伤的胰腺组织反复刺激体内单核巨噬细胞，进一步产生更多的炎症因子，严重的炎症反应可带来内质网应激损伤，同时可作用于血管内皮细胞引起感染性休克等[8]。本实验通过TNF-α水平证实SAP模型制备成功，外源性Apelin-13对SAP治疗有效。

IL-6是一种在全身炎症反应中处于核心地位的细胞因子，SAP时IL-6显著增高，异常增高的IL-6刺激人体产生大量抗体及CRP引起细胞毒性作用，高浓度IL-6还可与TNF-α产生协同作用产生起微循环血栓损伤机体[9]，从而引起全身多器官损伤反应。因而IL-6增高水平与SAP严重程度密切相关[10]，IL-6成为人们研究SAP疾病发生发展的重要标志物。本实验通过IL-6水平再次证实SAP模型制备成功，外源性Apelin-13对SAP治疗有一定效果。

NO是血管内皮细胞被激活后产生的一种调节血管活性的信号分子。人体内NO合成有NOS催化和非NOS催化(服用硝酸甘油等)两种途径，NOS途径指内毒素等刺激血管内皮细胞后被激活的NOS通过L-精氨酸转变为L-瓜氨酸的过程产生维持正常生命所需的NO。NOS是调控NO合成的最重要蛋白，有3种不同存在形式(iNOS、eNOS和nNOS)，其中性质较为相似的两种高度依赖Ca2+的蛋白质酶eNOS和nNOS又称为cNOS。正常情况下cNOS体内含量较少，能够产生供机体需要量的NO，低浓度的NO在体内可作为传递介质和调节介质传递信号，可促进外周血管舒张、维持血管的稳定，因而低浓度的NO对机体有保护作用。iNOS在生理状态呈不表达或低表达状态，SAP时在细胞因子TN F-α、干扰素、内毒素等的诱导下进行转录和翻译，iNOS持续高表达产生大量NO[11]。高浓度的NO不仅具有强烈扩血管作用，扩张外周血管增加通透性，通过诱导NF-κB产生大量炎症因子，引起更严重的全身炎症反应[12]，同时高浓度NO还可增强线粒体酶活性产生细胞毒性作用，甚至可以通过抑制DNA复制和三羧酸循环中部分关键酶引起DNA复制障碍及能量代谢紊乱。由此可见，NO在不同浓度下对SAP起着完全相反的调节作用，高浓度的NO通过不同机制可对机体造成严重损害，而低浓度NO却可以维持机体稳态。在本实验中，空白组NO含量始终处于较低水平，说明生理状态下低浓度的NO有利于机体稳态的维持。SAP组NO含量明显高于其他两组，i NOS活性亦明显高于其他两组，证明了i NOS被诱导激活后可产生高浓度的NO造成严重组织损伤。治疗组NO含量、i NOS和e NOS含量处于其他两组之间，说明了大鼠治疗有效与降低SAP大鼠体内NO含量相关。Apelin-13分子作用机制至今尚未完全阐明，但其拥有着十分广泛的生物学作用，可启动Apelin/APJ系统，在中枢和外周发挥其调节体液平衡、扩血管、降血压、促进血管生成、促消化、抗炎并可抑制凋亡等作用，因此Apelin-13有着广阔的发展空间和重要的研究意义。

本实验通过外源性Apelin-13治疗SAP模型大鼠了解了外源性Apelin-13对于SAP大鼠的治疗效果极其可能机制。通过单纯组、SAP组及治疗组三组间下腔静脉血淀粉酶、IL-6、 TN F-α、NO浓度及胰腺组织匀浆中i NOS、e NOS含量的对比与HE染色结果，进一步明确外源性Apelin-13对SAP的治疗效果。结果显示：SAP组大鼠胰腺静脉血中血淀粉酶、IL-6、TN F-α、NO浓度与组织中i NOS均高于单纯组，eNOS则低于单纯对照组。Apelin-13治疗组中静脉血中血淀粉酶、IL-6、 TN F-α、NO浓度与组织中i NOS均高于单纯对照组而低于胰腺炎组，eNOS则显著高于其他两组。可以看出，外源性Apelin-13对SAP治疗效果明确，可能是通过干预体内iNOS激活诱导产生的NO含量及从而引起IL-6、 TN F-α等炎症因子水平降低达到治疗目的。

综上所述，SAP进展过程中，iNOS活性不断增高，eNOS活性不同程度的降低，体内NO含量明显增多，加剧机体组织损伤。注射外源性Apelin-13治疗后，治疗组iNOS活性明显降低，而eNOS活性则出现不同程度升高，iNOS激活产生的具有强烈组织损伤作用的NO大幅降低，而eNOS催化的具有保护组织效用的NO有所提升，从而保护机体组织。外源性Apelin-13早期可以显著下调大鼠血清淀粉酶、IL-6、TN F-α浓度，从而降低SAP大鼠炎症损害改善胰腺组织的坏死进程。提示在SAP早期应及时治疗，以降低炎症损害，达到治疗目的。