丙泊酚抑制缺氧/复氧HUVECs细胞中miR-15b表达及细胞凋亡的实验研究*

霍彦龙,郝璞珩,田 道

1.延安大学附属医院(延安716000);2.陕西省吴起县人民医院麻醉科(吴起717600);3.西安医学院第一附属医院神经外科(西安710077);4. 陕西省荣誉军人康复医院麻醉科(渭南714200)

丙泊酚(Propofol)是目前临床中应用广泛的静脉麻醉剂，具有起效迅速、苏醒率高、副作用少等特点，因其化学结构本质类似于抗氧化物，故在应用过程中能够发挥相关作用[1-2]，有益于减轻围手术期缺血再灌注损伤(Ischemia/Reperfusion,I/R)。有研究表明[3]，丙泊酚能够对大鼠围手术期过氧化氢(H2O2)诱导的心肌细胞凋亡发挥保护作用，从而减轻心肌I/R损伤。微小RNA(miRNA)作为一种非编码短链RNA，通过对其靶基因的调控，在包括神经病理性疼痛在内的诸多生理过程中发挥相关作用[4-6]，其在I/R发展过程中对于心、肾脏器损害的中作用已得到了初步认同[7]。有研究表明[8]，丙泊酚干预下的缺氧状态的血管内皮细胞中存在差异性表达的miRNA，能够参细胞自噬生理过程的调节，这其中就包括miR-15b。miR-15b与抗凋亡蛋白bcl-2间的靶向关系已明确[9]，丙泊酚是否能够通过该途径发挥其组织、细胞保护作用，值得探究。I/R动物模型具有不稳定性，易受到体内多方面因素的影响，故而在体外不能确切地反映出药物对组织、细胞损伤的保护机制；而体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)方法简便、可控性较好[10]，故本研究拟建立缺氧/复氧细胞模型，对丙泊酚与miR-15b之间的相互作用机制进行探讨。

材料和方法

1 主要试剂、仪器 DMEM培养基、小牛血清(Fetal bovine serum，FBS)(Gibco公司，美国，生产批号:31600034、1600-044)；FITC-兔抗人bcl-2单抗、兔抗人β-actin多抗、HRP标记的山羊抗兔二抗(Abcam公司，英国，生产批号：ab32124、ab8227、ab20272)；RNAisoTMPlus试剂盒(TaKaRa公司，日本，生产批号：D9108A)；细胞裂解液(索莱宝科技有限公司，中国，生产批号：R0020)，BCA蛋白定量试剂盒(索莱宝科技有限公司，中国，生产批号：PC0020)。Western-blot配胶试剂盒(泛思科技有限公司，中国，生产批号：FS201)。反转录试剂盒、荧光实时定量PCR反应试剂盒(TaKaRa公司，日本，生产批号：DRR047S、DRR096A)；丙泊酚注射液(西安力邦制药有限公司，中国，生产批号：H19990282)；膜联素Ⅴ/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒(翊圣生物公司，中国，生产批号：40302ES20)；细胞培养箱(Thermo公司，美国)；流式细胞仪(BD公司，美国)；凝胶电泳仪、化学发光成像系统、实时荧光定量PCR分析仪(Bio-Rad公司，美国)。

2 细胞培养 将购置的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)(ATCC细胞库，中国分公司)消化后，调整密度，接种于含10%FBS的DMEM完全培养液中，在5% CO2、37℃的培养箱中进行培养，初次接种后12 h换液，以后每24 h换液一次。2～3次传代后待细胞密度生长融合至80%～90%左右时，构建体外I/R细胞模型，进行后续实验；共分为三组，对照组：弃去各组细胞完全培养液，加入无血清、无糖培养液，置入培养箱中，以5% CO2、5% N2、37℃条件下培养24 h，随后换完全培养液，恢复正常有氧培养条件，培养6 h；实验组：缺氧/复氧培养条件与对照组相同，复氧后完全培养液中加入丙泊酚(150 μmol/L)，培养6 h；空白组细胞正常有氧条件培养。

3 实时定量PCR(RT-qPCR) 按RNAisoTMPlus试剂盒说明书，提取各组细胞中总RNA；检测RNA质量。根据PrimerBank公布的基因序列，设计miR-15b、bcl-2及内参U6的引物序列(见表1)；按试剂盒说明，反转录合成miR-15b、bcl-2 cDNA；根据实时定量PCR试剂盒说明配制反应体系后加样，以U6为内参，进行PCR反应，具体反应条件(见表1)。12%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，应用凝胶图象成像系统(Alpha Innotech公司)检测PCR产物质量。每个样本设置2个复孔，每批样本设置1孔空白对照。目的基因miR-10b、bcl-2的相对表达量采用公式2-△△Ct(△Ct=目的基因Ct值-内参照Ct 值，△△Ct=实验组△Ct-对照组△Ct)进行计算。

表1 引物序列及PCR反应条件

4 Western-blot 提取各组细胞中蛋白,按照BCA蛋白定量试剂盒说明书检测蛋白质含量；取50 μg蛋白进行电泳，电泳完成后切取目的蛋白bcl-2、β-actin所在胶片；转膜、染色、封闭后加兔抗人bcl-2抗体(1∶2500)、兔抗人β-actin抗体(1∶3000)孵育2 h；PBS漂洗后，加HRP标记的山羊抗兔抗体(1∶5000)，室温下孵育2 h；再次洗膜，进行化学发光反应。显影、定影后，对X线片扫描成像，目的蛋白的表达量以bcl-2/β-actin比值表示。

5 流式细胞仪检测细胞凋亡 将各组细胞消化，吹悬，用2.5 ml的磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline, PBS)洗涤2次，离心5 min(1000 r/min)；最后一次洗涤离心后，用1 ml PBS液轻柔吹悬细胞，呈单细胞悬液状态，随即加入2 ml无水乙醇固定，弃去上清，PBS液再次洗涤后，标记、待检。每个待检样本中均分别加10 μl Annexin V-FITC以及5 μl PI，混匀后避光条件下，于室温下反应15 min；随后用300目滤膜滤去细胞团块，上流式细胞仪检测。使用Expo32 ADC Analysis系统对细胞凋亡检测结果进行分析。

结 果

1 RT-qPCR检测结果 RT-qPCR结果显示，实验组miR-15b的表达水平低于对照组，实验组HUVECs细胞中bcl-2在mRNA的表达水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05，图1)。

图1 miR-15b及 bcl-2 mRNA的表达水平

2 Western-blot检测结果 Western-blot结果显示，经缺氧/复氧处理后，实验组和对照组HUVECs细胞中bcl-2表达均低于正常培养状态下的HUVECs细胞(空白组)，但实验组细胞中bcl-2在蛋白水平的表达高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

图2 bcl-2蛋白的表达水平

3 细胞凋亡检测结果 流式细胞术检测实验组、对照组、空白组中HUVECs细胞凋亡率。与对照组相比，空白组、实验组HUVECs细胞凋亡率降低(细胞凋亡率=B2+B4，即早期凋亡率+晚期凋亡率)，差异有统计学意义(P<0.05，见图3)。

图3 各组HUVECs细胞凋亡率

讨 论

分布于人体循环组织中的血管内皮细胞作为血管内外组织间的屏障，参与正常生理与诸多疾病过程[11]。缺血再灌注损伤细胞模型的构建，涉及通过活性氧(Reactive oxygen apecies，ROS)导致的氧化应激所诱发的血管内皮细胞损伤。作为有效的氧化还原剂，ROS通过脂质过氧化以及对还原酶的抑制作用直接损伤血管内皮细胞；此外，ROS还通过上调细胞粘附分子的表达、诱导细胞因子的转录，并刺激中性粒细胞的活化和趋化性，从而诱发内皮细胞凋亡增加。

丙泊酚在结构上类似于内源性抗氧化维生素E，并具有抗氧化活性，通过对抗氧化应激保护细胞免受损伤[1]。本研究中发现，实验组HUVECs在丙泊酚(150 μmol/L)干预下培养24 h后，细胞凋亡率下降；实验组HUVECs细胞中bcl-2在mRNA和蛋白水平的表达均高于对照组(P<0.05)。以上结果，进一步验证了丙泊酚对I/R的保护作用。一方面，丙泊酚干预状态下，能够通过激活与细胞存活直接相关的AKt信号通路以及抗凋亡蛋白bcl-2，抑制细胞凋亡过程[1]。另一方面，丙泊酚干预能够一定程度抑制自噬效应蛋白beclin-1的表达，并加强其与抗凋亡蛋白bcl-2的相互作用，减少过度自噬，降低细胞凋亡[12]。

上述途径中涉及的细胞自噬相关基因及凋亡相关蛋白均可由miRNA参与调节[13-14]，过度自噬能够引发细胞损伤、凋亡增加，丙泊酚干预下的缺氧状态的血管内皮细胞中存在差异性表达的miRNA，如miR-15b等[6]，能够参细胞自噬生理过程的调节。miR-15b能够影响多种细胞的增殖、凋亡能力[15]，其能够负性调控bcl-2；本研究中发现，实验组miR-15b的表达水平低于对照组，而bcl-2的表达高于对照组(P<0.05)，进一步印证了两者间的靶向关系。bcl-2能够与bax形成家族性二聚体，通过所形成二聚体(bcl-2/bax)的结构性比例变化参与调解细胞凋亡过程，其中bcl-2主要发挥抗凋亡作用[16]。因此，丙泊酚可能通过I/R细胞模型中miR-15b的介导，影响其靶基因bcl-2的表达，从而抑制细胞凋亡，但涉及三方的具体参与机制仍需后续深入。

综上，丙泊酚能够抑制人缺血再灌注损伤细胞模型中miR-15b的表达，并影响其靶基因抗凋亡蛋白bcl-2的表达，从而降低细胞凋亡率。为临床工作中围手术期麻醉药物的合理应用和选择提供了一定理论依据，并为缺氧缺血性麻醉并发症的防治提供了可能的分子靶标。