茯苓甘草汤对功能性消化不良大鼠的调节作用

曹 峰， 罗振亮， 秦 源， 丁 然， 唐阿梅， 刘 杨

（贵阳中医学院， 贵州 贵阳550025）

功能性消化不良是一种常见的消化系统疾病， 患者胃部并无明显器质性病变， 但有腹部疼痛或不适、 饱胀、 嗳气不舒、 呕逆等临床症状， 而且胃肠动力明显不足， 进食减少， 其发病原因和机制复杂不明。 《伤寒论》 中茯苓甘草汤功效温胃化饮、 通阳利水， 主治心下悸、 四肢不温、胃中痞满、 漉漉有水声、 舌淡苔滑， 这与功能性消化不良之中医证候的胃虚饮停证较相似。 课题组前期发现， 茯苓甘草汤对功能性消化不良大鼠乙酰胆碱酯酶活性有激活作用［1］， 故本实验以此为基础， 进一步考察该方针对功能性消化不良改善作用的潜在靶点。

1 材料

1.1 药物 茯苓甘草汤中的茯苓、 桂枝、 甘草、 生姜购自贵州同济堂药业有限公司， 经贵阳中医学院董丽莎教授鉴定为正品。 按《伤寒论》 原方， 取茯苓2 两（30 g）、 桂枝2两（30 g）、 炙甘草1 两（15 g）、 生姜3 两（45 g）， 配伍后打粉， 过100 目筛， 10 倍蒸馏水煎煮1 次， 8 倍蒸馏水煎煮2 次， 过滤后合并滤液， 60 ℃下缓慢蒸发至所需浓度溶液后保存备用（每1 mL 相当于原方剂药材量1 g）。 多潘立酮片，批号170306533， 由西安杨森制药有限公司提供。

1.2 动物 SD 大鼠， 雌雄各半， 体质量180～220 g， 由长沙天勤生物技术有限公司提供， 动物许可证号SCXK（湘） -2014-0011， SPF 级环境饲养， 室温20～26 ℃， 实验动物伦理委员会批准编号1509005， 动物饲料也由上述单位提供。

1.3 试剂 AQP4、 Leptin、 eNOS、 β-actin 抗 体， 货 号ab9512、 ab117751、 ab76198、 ab8227， 由英国Abcam 公司提 供； ZO-2、 YAP、 CGRP 抗 体， 货 号 2847、 4912、14959， 由美国CST 公司提供； 山羊抗兔HRG 抗体， 批号109525， 由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。 SDSPAGE 凝胶制备试剂盒， 货号G1120； BCA 蛋白浓度定量试剂盒， 货号PC0020； ECL 发光剂， 货号PE0010， 由北京索莱宝生物科技有限公司提供。

1.4 仪器 电子数显游标卡尺， 由上海美耐特五金工具公司提供； KD-202A 石蜡切片机， 由浙江科迪仪器设备有限公司提供； CX21 型光学显微镜， 由日本Olympus 公司提供。

2 方法

2.1 分组及给药 60 只大鼠随机分为空白组、 模型组、茯苓 甘 草 汤 组 （ 20、 10、 5 g／kg）、 多 潘 立 酮 组（0.004 g／kg）， 每组10 只， 空白组大鼠灌胃给予常温生理盐水， 其余各组大鼠给予0 ℃、 0.5 mol／L 稀盐酸诱导功能性消化不良模型［1］。 14 d 后， 正常组、 模型组大鼠给予常温生理盐水， 其余各组大鼠给予常温相应浓度药物， 每天灌胃给药1 次， 连续7 d， 末次给药1 h 后， 检测各组大鼠肠推进功能， 并取胃组织置于4%多聚甲醛中， -80 ℃下保存备用。

2.2 大鼠肠推进功能测定 各组大鼠末次给药前禁食8 h后， 给予半流质饲料和碳粉混合物， 2 g／只， 10 min 后药物干预， 30 min 后取小肠平铺， 测量半流质饲料和碳粉混合物从幽门括约肌推动到回盲部的距离， 进行记录和统计分析。

2.3 大鼠胃组织AQP4、 Leptin、 eNOS 蛋白表达检测 采

用免疫组化法。 大鼠胃组织用自来水冲洗4 h， 不同体积分数乙醇（由低到高） 各脱水1 h， 二甲苯透明2 次， 每次20 min， 液体石蜡中浸泡2 次， 每次1.5 h， 包埋； 切片机上切片， 常规二甲苯脱蜡2 次， 每次15 min， 不同体积分数乙醇（由高到低） 水化， PBS 浸泡后3% 过氧化氢封闭10 min 以阻断内源性过氧化物酶， PBS 冲洗后滴加Ⅰ抗，4 ℃孵育后滴加Ⅱ抗， DAB 显影后， 自来水冲洗， 复染，脱水， 透明， 封片。

2.4 大鼠胃组织ZO-2、 YAP、 CGRP 蛋白表达检测 采用蛋白印迹法。 BCA 蛋白定量试剂盒蛋白定量后， SDS-PAGE凝胶制备试剂盒制备12% 分离胶和5% 浓缩胶， 上样后电泳1 h， 转膜2 h， 5%脱脂奶粉封闭2 h 后加Ⅰ抗， 其中内参Ⅰ抗1 ∶8 000、 其他Ⅰ抗1 ∶3 000， TBST 冲洗3 次， 加入Ⅱ抗1 ∶7 000， TBST 冲洗3 次， ECL 发光液显影。

2.5 统计学分析 通过SPSS17.0 软件进行处理， 数据以（±s）表示， 组间比较采用非参数秩和检验。 以P＜0.05 为差异有统计学差异。

3 结果

3.1 茯苓甘草汤对大鼠肠推进功能的影响 与空白组比较， 模型组大鼠肠功能推进距离显著缩短（P＜0.01）； 与模型组比较， 茯苓甘草汤20、 10 g／kg 组其距离显著增加（P＜0.01）。 见表1。

表1 茯苓甘草汤对大鼠肠推进功能的影响（±s， n＝8）

表1 茯苓甘草汤对大鼠肠推进功能的影响（±s， n＝8）

注：与空白组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，∗∗P＜0.01

组别 剂量／（g·kg-1）肠功能推进距离／mm空白组 — 23.53±5.58∗∗模型组 — 15.71±2.57＃＃茯苓甘草汤组 20 23.06±4.21∗∗茯苓甘草汤组 10 21.86±3.88∗∗茯苓甘草汤组 5 19.96±5.91多潘立酮组 0.004 23.16±3.94∗∗

3.2 茯苓甘草汤对大鼠胃组织AQP4、 Leptin、 eNOS 蛋白表达的影响 AQP4、 Leptin、 eNOS 蛋白大多表达于胃黏膜腺泡内（图1～3）； 与模型组比较， 茯苓甘草汤各剂量组AQP4 蛋白表达显著升高（P＜0.05， P＜0.01）， Leptin 蛋白表达显著降低（P＜0.05）， 并且20、 10 g／kg 组eNOS 蛋白表达也显著降低（P＜0.05， P＜0.01）。 见表2 （以光密度表示）。

图1 茯苓甘草汤对大鼠胃组织AQP4 蛋白表达的影响（×400）

图2 茯苓甘草汤对大鼠胃组织Leptin 蛋白表达的影响（×400）

图3 茯苓甘草汤对大鼠胃组织eNOS 蛋白表达的影响（×400）

表2 茯苓甘草汤对大鼠胃组织AQP4、 Leptin、 eNOS 蛋白表达的影响（±s， n＝5）

表2 茯苓甘草汤对大鼠胃组织AQP4、 Leptin、 eNOS 蛋白表达的影响（±s， n＝5）

注：与模型组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01

组别 剂量／（g·kg-1）AQP4 Leptin eNOS空白组 - 0.59±0.20∗∗ 0.41±0.14∗ 0.33±0.14∗模型组 - 0.32±0.11 0.61±0.13 0.57±0.21茯苓甘草汤组 20 0.57±0.17∗∗ 0.42±0.20∗ 0.33±0.13∗茯苓甘草汤组 10 0.57±0.27∗ 0.38±0.22∗ 0.32±0.11∗∗茯苓甘草汤组 5 0.54±0.22∗ 0.40±0.21∗ 0.47±0.23多潘立酮组 0.004 0.47±0.17 0.49±0.07 0.41±0.16

3.3 茯苓甘草汤对大鼠胃组织ZO-2、 YAP、 CGRP 蛋白表达的影响 与模型组比较， 茯苓甘草汤各剂量组ZO-2 蛋白表达上调， 以10 g／kg 组更显著（P＜0.05）； 各剂量组YAP蛋白表达显著下调（P＜0.05， P＜0.01）； 各剂量组CGRP蛋白表达下调， 以20、 10 g／kg 组更显著（P＜0.05， P ＜0.01）。 见图4、 表3 （以光密度表示）。

4 讨论

图4 茯苓甘草汤对大鼠胃组织ZO-2、 YAP、 CGRP蛋白表达的影响

表3 茯苓甘草汤对大鼠胃组织ZO-2、 YAP、 CGRP 蛋白表达的影响（±s， n＝5）

表3 茯苓甘草汤对大鼠胃组织ZO-2、 YAP、 CGRP 蛋白表达的影响（±s， n＝5）

注：与模型组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01

组别 剂量／（g·kg-1）ZO-2／β-actin YAP／β-actin CGRP／β-actin空白组 — 0.22±0.05∗ 0.29±0.16∗∗ 0.07±0.03∗模型组 — 0.09±0.01 0.80±0.05 0.15±0.03茯苓甘草汤组 20 0.22±0.07 0.44±0.17∗ 0.05±0.02∗∗茯苓甘草汤组 10 0.42±0.10∗ 0.38±0.17∗∗ 0.07±0.04∗茯苓甘草汤组 5 0.32±0.21 0.51±0.19∗ 0.13±0.08多潘立酮组组 0.004 0.21±0.17 0.62±0.18 0.09±0.06

随着社会发展、 生活压力不断增加， 功能性消化不良发病率逐年增加， 其诱因与脑肠轴失衡、 慢性炎症、 内脏感觉异常、 幽门螺旋杆菌感染、 精神相关因素、 饮食生活失约等有密切联系［2-3］。 AQP4 蛋白作为跨膜转运蛋白， 广泛分布于胃部上皮细胞层内， 对胃酸分泌、 水分转运、 渗透压调节起到重要作用［4］； 瘦素（leptin） 分布于胃主细胞和壁细胞内， 其分泌受到饮食及神经-激素调节影响， 可减少食物摄入、 分解脂肪促进机体能量代谢， 并可激活下游JAK、 PI3K 等信号通路参与胰岛素分泌调节、 炎症反应等病理过程［5］； 内皮型一氧化氮合酶（eNOS） 以L-精氨酸为底物合成NO， 参与血管舒缩调节、 抑制血小板凝集、 保护内皮细胞等［6］， 在消化系统中可能参与调节胃肠黏膜血流、 调节胃肠黏膜分泌功能以及保护胃肠黏膜， 目前普遍认为NO 增多会引起胃肠动力减弱； YAP 是Hippo 信号通路的下游蛋白， 有着调节器官发育、 诱发癌症、 促进细胞增殖、 双向调节细胞凋亡、 调节细胞密度和分布发生变化等作用［7-8］； ZO-2 是紧密连接蛋白家族成员之一， 存在于细胞紧密连接、 黏附连接和缝隙连接处， 在上皮细胞和内皮细胞间起着连接作用， 作为骨架蛋白， 它是胃肠黏膜屏障正常功能发挥和生理结构完整性的重要保护蛋白， 对维持水分子、 细胞大分子等物质进行细胞旁通透有重要意义，其异常表达会造成胃肠黏膜紧密连接功能异常和组织渗透压失衡， 并可通过携带的PDZ 结构域在细胞核与细胞质之间自由穿梭， 与YAP 蛋白所携带的PDZ 结合序列相结合发挥生物学活性， 它既可促进YAP 蛋白进入细胞核激活其活性， 又可将其滞留在细胞质中抑制活性的发挥； 降钙素基因相关肽（CGRP） 是与痛觉调控相关的神经活性肽， 广泛存在于胃肠道， 其分泌增高可引起胃黏膜血流量增加、减缓胃肠运动、 痛觉传导异常敏感， 导致内脏高敏感性［9-10］。

本实验发现， 茯苓甘草汤具有明显的促进胃肠运动作用， 与多潘立酮功效相当， 甚至在一定程度上表现更好。给予茯苓甘草汤后， 可改善因稀盐酸诱导消化不良造成的胃肠蠕动迟缓， 促进肠推进功能； 升高胃黏膜AQP4 蛋白表达， 增强胃内水液转运； 降低胃内Leptin 高表达， 增强食欲提高胃肠蠕动； 降低胃黏膜eNOS 过表达， 减轻NO 过度生成， 增强胃肠动力； 上调ZO-2 蛋白表达， 促进组织或细胞间紧密连接； 抑制YAP 蛋白在胃内过表达， 减轻黏膜细胞过度增殖； 降低CGRP 蛋白过表达， 增强胃肠蠕动，由此推测， 对这些蛋白的调节作用可能是该方改善功能性消化不良的潜在作用机制。