姜制附子对大鼠机体热性的影响

童恒力， 钟凌云， 祝 婧

（江西中医药大学， 江西 南昌330004）

宋代《博济方》 中有记载姜制附子的方法， 云“去皮脐， 生切作四块， 用生姜半觔， 用水一碗同煮附子， 汁尽为度， 取附子焙干为末”； 《类编朱氏极验医方》 也提出“大附子， 慎火， 炮裂去皮， 切作拾片， 用生姜， 米泔淹一宿， 去姜， 薄切焙干”； 樟帮的临江片采用生姜片拌蒸、 经米泔水漂洗过的附子， 而建昌帮的阴附片则使用生姜汁闷润附子后蒸制。 附子性大热、 有毒， 传统中医理论有“附子无姜不热” 的说法， 而且有研究表明姜辣素对其毒性成分有抑制作用［1］， 故姜制附子有一定的理论基础。

舌诊是中医的一种辨证方法， 可通过舌像辨别机体的寒热虚实状态， 以及气血津液的盛衰， 现代科学也证实舌像变化可反映机体的健康状态［2］， 目前提倡通过实验过程中动物所表现出的宏观表征来辨析中医证候， 从而能更好地从中医思路出发开展研究［3］。

Na＋-K＋-ATP 酶是一种体内广泛存在的细胞膜蛋白， 其消耗很大一部分机体新陈代谢的能量来维持细胞内外离子平衡， 以及调节一些能量物质的运输［4-5］； 前列腺素E2（PGE2） 是具有多种生理功能的活性物质， 其与EP3 受体结合是发挥致热作用的基础［6］； 肾上腺素（EPI） 能使机体呼吸加深加快（摄入大量氧气）， 加速心跳与血液流动，为机体活动提供更多能量。 本实验通过上述能量相关指标研究姜制对附子药性变化的影响， 为临床使用相关饮片提供一定参考。

1 材料

1.1 动物 SD 雄性大鼠， 体质量（200±20） g， 共84 只（其中28 只作预实验用）， 购于济南朋悦实验动物繁育有限公司， 动物生产许可证号SCXK （鲁） 20140007， 检疫后备用。

1.2 药材 盐附子购自四川江油， 生姜购自广东高明区，母姜购自四川犍为， 均由江西中医药大学中药鉴定学教研室葛菲教授鉴定为正品。

1.3 姜制品

1.3.1 干姜片 犍为母姜切片（约0.3 cm 厚）， 低温烘干， 即得。

1.3.2 生姜榨汁 取生姜洗净切片， 加水反复压榨4 次，合并， 过滤， 低温浓缩。

1.3.3 生姜煎汁 取生姜洗净切片， 加水煎煮3 次， 合并汁液， 过滤， 浓缩。

1.3.4 干姜煎汁 取干姜煎煮3 次， 合并汁液， 过滤，浓缩。

1.3.5 干姜片（生姜片） 拌蒸附子 将附子洗去盐分，冷水漂洗数天并经常换水， 除去外皮， 切片， 米泔水漂洗数天， 取适量生姜片（干姜片） 拌匀， 置于蒸笼中蒸制，低温烘干， 即得。

1.3.6 干姜煎汁（生姜煎汁、 生姜榨汁） 拌蒸附子 将附子洗去盐分， 冷水漂洗数天并经常换水， 烘干， 加入适量干姜煎汁（生姜煎汁、 生姜榨汁）， 闷润后置于蒸笼中蒸制， 切成薄片， 低温烘干， 即得。

1.4 煎剂 生附子加10 倍量水浸泡45 min， 沸腾后第1次煎煮30 min， 第2 次加6 倍量水， 沸腾后煎煮30 min，纱布滤过， 合并煎液， 减压浓缩后置于冰箱冷藏保存备用。同法制备姜制附子煎剂。

1.5 试药及仪器 25%戊二醛溶液（国药集团化学试剂有限公司， 100 mL， 批号20131217）； 水合氯醛（上海凌峰化学试剂有限公司， 250 g， 批号20150703）； 超微量ATP（Na＋K＋） 测 试 盒 （2-1、 2-2） （100 T／50 样， 批 号20170419）、 考马斯亮兰 （100 T／96 样， 批号20170421，南京建成生物工程研究所）； 大鼠肾上腺素（EPI， 批号CSB-E08678r）、 大 鼠 前 列 腺 素E2（PGE2， 批 号 CSBE07967r） ELISA 试剂盒（96T， 武汉华美生物工程有限公司）。 电子天平（型号YB502N， 上海海康电子仪器厂）；扫描电子显微镜（型号S-570， 日本日立公司）； 紫外可见分光光度计（型号UV8000S， 上海元析仪器有限公司） ；旋转蒸发仪（型号RE52CS， 上海亚荣生化仪器厂）； 循环水式真空泵（型号SHZ-DⅢ， 巩义市予华仪器有限责任公司）； 代谢笼。

2 方法

2.1 分组及给药 将56 只大鼠随机分为7 组， 每组8 只，分别为空白组、 干姜煮汁制附子组、 生姜煮汁制附子组、生姜榨汁制附子组、 干姜片拌蒸制附子组、 生姜片拌蒸制附子组、 生附子组， 各组给药剂量均为1.54 g 生药／kg（按2015 版《中国药典》 成人临床最大用药量60 kg 体质量换算）， 每天灌胃给药1 次， 灌胃量为15 mL／kg 体质量，连续31 d， 其间不间断提供饲料和水。

2.2 热性证状指标检测

2.2.1 舌像 各组大鼠在实验第31 天给药1 h 后处死， 镊子顶开大鼠上下颌暴露出舌体， 轻拉出舌体， 同时于舌体根部用手术剪剪断， 迅速用生理盐水清洗舌体， 将舌体固定于2.5%戊二醛溶液中备用。 从固定液中取出大鼠舌体，0.1 mol／L 磷酸盐缓冲液漂洗干净后， 1% 锇酸固定至少2 h， 50%、 70%、 90%、 95% 乙醇逐步进行脱水处理， 再换成醋酸异戊酯， 每次浸泡约15 min， 干燥舌体后， 扫描电镜观察微观结构。

2.2.2 宏观体征 各组大鼠预置于代谢笼内饲养3 d 以适应环境， 首次灌胃给药前称定体质量， 肛温计测量肛温，从给药当天起每5 d 记录1 次肛温、 饮食量、 饮水量， 再称定体质量， 共观察31 d。

2.2.3 肝组织Na＋-K＋-ATP 酶活性 末次给药1 h 后， 大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉， 剂量0.3 mL／kg 体质量，开腹分离肝脏周遭韧带， 迅速剪取活体肝组织， 立即用磷酸缓冲盐溶液清洗， 锡箔纸包裹后置于液氮中保存， 再转移至-80 ℃冰箱中。 精密称取肝组织1 g， 冰浴下加入9 mL生理盐水匀浆， 均匀匀浆后3 000 r／min 离心约10 min， 取上清液， 加入9 倍量生理盐水制成1%肝组织匀浆液， 按照考马斯亮蓝试剂盒及超微量Na＋-K＋-ATP 酶测试盒说明书进行操作。

2.2.4 血清EPI、 PGE2水平 末次给药1 h 后， 大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉， 剂量0.3 mL／kg 体质量， 备皮，开腹， 腹 主 动 脉 取 血， 凝 固 （4 ℃） 60 min 后 离 心（3 000 r／min） 5 min 得到血清， 置于-20 ℃冰箱中保存备用， 按照EPI、 PGE2血清试剂盒说明书进行操作。

2.3 统计学分析 通过SPSS 19.0 统计软件进行处理， 计量资料以（±s）表示， 不满足统计学要求的数据进行转换，组间比较采用单因素方差分析。 以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 舌像

3.1.1 姜制对大鼠舌体丝状乳头数目的影响 与空白组比较， 各姜制附子组大鼠舌体丝状乳头数目均有不同程度的增加， 以生姜煮汁制附子组更显著（P＜0.05）。 见表1。

表1 姜制对大鼠舌体丝状乳头数目的影响（±s， n＝8）

表1 姜制对大鼠舌体丝状乳头数目的影响（±s， n＝8）

注：与空白组比较，∗P＜0.05

组别 丝状乳头数目空白组 60.63±10.68生附子组 66.25±10.26生姜榨汁制附子组 67.38±22.51生姜煮汁制附子组 80.13±20.83∗生姜片制附子组 79.00±26.54干姜煮汁制附子组 67.88±18.47干姜片制附子组 61.25±12.46

3.1.2 姜制对大鼠舌体丝状乳头角质化程度的影响 与空白组比较， 生附子组大鼠舌体丝状乳头基部更粗糙， 但角质变厚， 剥落现象不明显； 生姜制附子组大鼠舌体丝状乳头基部角质化程度明显， 角质层厚， 裂纹及脱落严重； 干姜制附子组大鼠丝状乳头表面凹凸不平， 角质层厚且粗糙，脱落现象不明显。 见图1。

3.1.3 姜制对大鼠舌体蕈状乳头角质化程度的影响 与空白组比较， 生附子组大鼠蕈状乳头角质层更厚； 与空白组、生附子组比较， 各姜制附子组大鼠蕈状乳头周遭有大量角质层包裹， 而且角质层厚， 裂纹多， 有剥落痕迹。 见图2。

3.2 宏观体征

3.2.1 体质量 各组大鼠体质量均无明显变化。

3.2.2 肛温 除空白组、 生姜片制附子组外， 各组大鼠肛温在给药后出现下降趋势， 在第6 ～11 天开始回升或上升变快， 在第16 天左右开始下降， 在第21 天后又开始上升，从第26 天起与空白组相比， 除生附子组、 生姜榨汁制附子组外均有显著差异（P＜0.05）。 见图3。

3.2.3 饮食量 各组大鼠饮食量随饲养时间延长均有略微增多趋势， 但无明显变化。

3.2.4 饮水量 各组大鼠饮水量随饲养时间延长逐渐增加， 从第26 天起开始超过空白组， 并随时间推移出现显著差异（P＜0.05）。 见图4。

3.3 肝组织Na＋-K＋-ATP 酶活性 与空白组比较， 生附子组、 干姜煮汁制附子组大鼠Na＋-K＋-ATP 酶活性显著降低（P＜0.01）； 与生附子组比较， 各姜制附子组其活性均显著升高（P＜0.01）。 见表2。

图1 姜制对大鼠舌体丝状乳头角质化程度的影响（×1 000）

图2 姜制对大鼠舌体蕈状乳头角质化程度的影响（×1 000）

图3 各组大鼠肛温变化

表2 姜制对大鼠肝组织Na＋-K＋-ATP 酶活性的影响（±s，n＝8）

表2 姜制对大鼠肝组织Na＋-K＋-ATP 酶活性的影响（±s，n＝8）

组别 Na＋-K＋-ATP 酶活性／（U·mg prot-1）空白组 4.67±0.51＃＃生附子组 2.72±0.29∗∗生姜榨汁制附子组 4.12±0.68＃＃生姜煮汁制附子组 4.30±0.59＃＃生姜片制附子组 4.60±0.36＃＃干姜煮汁制附子组 4.09±0.61＃＃∗∗干姜片制附子组 4.76±0.72＃＃

图4 各组大鼠饮水量变化

注：与空白组比较，∗∗P＜0.01；与生附子组比较，＃＃P＜0.01 3.4 血清EPI、 PGE2水平 由于血清EPI、 PGE2水平指标个体差异较大， 为了避免数据统计无意义， 在数据处理时对其进行对数转换以符合统计学要求。 与空白组比较， 除干姜片制附子组两者水平显著降低（P＜0.05） 外， 各组均有升高趋势， 以生姜榨汁制附子组更显著（P＜0.05）。 见表3。

4 讨论

动物模型是实验研究的基础［7］， 大鼠与人类相似， 具备中医诊断和证候的变化， 并且模型易于推广［8］。 中医看病注重舌苔变化， 舌与脏腑有着密切联系， 可通过舌像来了解机体状态本质， 其中体质量、 肛温、 饮食量、 饮水量能最客观直接地反映出机体的形体及生理状态， 能较好地符合中医对人体问诊的过程， 故选择上述指标作为外在表征。 Na＋-K＋-ATP 酶存在于细胞膜上， 维持着细胞静息电位， 与细胞摄入能量营养物质、 排出代谢产物密切相关，可反映细胞活动状态［9］； 肾上腺素是一种能使人新陈代谢大大加速的激素和神经传递物质， 可增加小血管阻力， 强化心肌收缩和耗氧， 增加机体中央血流量［10］； 前列腺素E2可双向调节血压［11］， 并对人体免疫系统有着复杂的调节作用［6］， 同时在人体致热过程中发挥重要作用， 故选择上述指标作为内在表征。

表3 姜制对大鼠血清EPI、 PGE2 水平的影响（±s， n＝8）

表3 姜制对大鼠血清EPI、 PGE2 水平的影响（±s， n＝8）

注：与空白组比较，∗P＜0.05；与生附子组比较，＃P＜0.05

组别 EPI PGE2空白组 1.01±0.25 0.89±0.19生附子组 1.38±0.47 1.27±0.44生姜榨汁制附子组 1.43±0.58∗ 1.35±0.58∗生姜煮汁制附子组 1.11±0.49 1.00±0.47生姜片制附子组 1.10±0.35 1.02±0.37干姜煮汁制附子组 1.20±0.35 1.14±0.39干姜片制附子组 0.87±0.26＃ 0.77±0.32＃

中医热症有舌体发红、 舌苔厚且黄、 口渴、 体温不稳等症状［12］， 舌诊是中医观察疾病的基本手段之一［13］， 《皇帝内经》 中即有记载与理论， 现有研究也认为舌有丰富的血管与神经分布， 对机体健康状态有着灵敏直接的反应［14］。 本实验发现， 各姜制附子组大鼠舌乳头均有数目增多、 角质层明显增厚的现象， 导致舌苔发黄发厚， 呈现热证舌像， 表明生附子及姜制附子均有令机体产生热性证状的趋势， 同时各组大鼠肛温变化不定， 饮水量在给药后期也与空白组出现显著差异， 这些体征指标也均符合中医临床热症的体征表现， 均对机体有肯定的致热作用。 另外，大鼠体质量、 饮食量无明显变化， 可能原因是给药量不高，在临床人使用剂量范围内换算对大鼠的热性影响比较缓和，具体有待进一步研究。

同时， 生附子组大鼠Na＋-K＋-ATP 酶活性与其他各姜制附子组比较显著偏低， 导致细胞能量生成和消耗出现障碍， 使得心肌细胞紊乱， 引起心脏疾病发生［9］， 可能也是附子毒性发挥的机制之一； 各种姜制附子组大鼠Na＋-K＋-ATP 酶活性与生附子组比较均有显著提高， 表明姜制可缓解其毒性。

肾上腺素（EPI） 可增加机体对能量的消耗， 而前列腺素E2（PGE2） 在机体致热过程中发挥重要作用［6］。 本实验发现， 除干姜片制附子组两者水平与空白组比较显著降低外， 各组均有不同程度的升高趋势， 以生姜榨汁制附子组更显著， 表明姜制附子可在一定程度上提高大鼠机体产热和能量代谢水平， 尤其是生姜榨汁制附子， 其原因可能是未经加热处理过的姜汁中某些成分可与附子成分发挥协同作用， 具体还有待进一步研究。

通过考察大鼠体内、 外热性证状指标显示， 各姜制附子组中生姜榨汁制附子对机体热性影响最为突出。 生姜榨汁是唯一在附子蒸煮加工前使用未经加热处理的姜产品长时间润制药材的辅料， 由于姜在加热后所含挥发油、 姜辣素、 游离氨基酸微量元素等成分的含有量均降低［15］， 而且中医理论认为干姜汁主制药物寒性， 鲜姜汁缓和药物毒副作用， 同时生姜解表， 干姜温里［16］， 故附子炮制后的药性变化可能与鲜姜汁中含有量较高的成分有更大关联。

综上所述， 本实验通过热性的机体内、 外表征指标，考察了基于樟帮、 建昌帮炮制的不同姜辅料所制备附子饮片对大鼠机体的影响， 发现各种姜辅料均可对附子产生一定解毒作用， 并在一定程度上加强附子热性， 以生姜榨汁制附子最显著。 今后， 将开展不同姜辅料和姜制附子成分分析及动物代谢组学、 物质能量代谢等方面的考察， 以期对其药性和药效进行探讨。