HPLC 法同时测定肿节风三清颗粒中2 种成分

陶 卿， 刘 磊， 唐廷崇， 吴文健， 何家康

（1. 广西北斗星动物保健品有限公司， 广西 南宁530001； 2. 广西大学， 广西 南宁530004）

肿节风为金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.） Nakai 的干燥全草， 主产于四川、 福建、 广西等地， 其味苦、 微辛， 性平， 归心、 肝经， 具有清热凉血、活血化瘀、 祛风通脉等功效， 用于血热发斑发疹、 风湿痹痛、 跌打损伤［1-2］。 肿节风三清颗粒是将肿节风、 射干、 甘草按中兽医理论组方制成的颗粒， 具有祛痰、 平喘、 止咳等功效， 临床用于鸡慢性支气管炎等呼吸道疾病。 现行兽药典［3］中收载了肿节风， 但仅检测异嗪皮啶含有量， 而现有研究表明迷迭香酸具有抗菌、 抗血栓、 抗血小板聚集等生物活性， 与肿节风药理作用和临床适应症相吻合［4-6］， 故为了提高产品质量， 准确检测出产品中异嗪皮啶、 迷迭香酸含有量显得尤为重要。 参考文献［7-9］， 本实验建立HPLC 法同时测定肿节风三清颗粒中异嗪皮啶、 迷迭香酸的含有量， 以期为该制剂质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AT 高效液相色谱仪， 配置SPD-20A 紫外检测器、 SIL-20A 自动进样器， 购于日本岛津制作所；BP211D 电子分析天平， 购于德国赛多利斯公司； TU-1901紫外可见分光光度计， 购于北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 试药 肿节风三清颗粒（批号20121001）， 由广西北斗星动物保健品有限公司提供。 异嗪皮啶、 迷迭香酸对照品均购于中国食品药品检定研究院（批号110837-201206、11871-201102）。 肿节风、 射干、 甘草均购于南宁生源中药饮 片 有 限 责 任 公 司 （ 批 号 20110501、 20110901、20110801）， 经广西中医药大学药用植物教研室银胜高副教授鉴定为正品。 乙腈、 甲醇、 磷酸均为色谱纯； 水为超纯水。

2 方法

2.1 色谱条件 Phenomenex Luna C18色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）， 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 流动相乙腈（A） -0.1% 磷酸（B）， 梯度洗脱（0 ～5 min，10%A； 5～25 min， 10% ～18% A； 25 ～52 min， 18% ～25%A； 52～60 min， 25% ～100%A）； 体积流量1.0 mL／min； 检测波长330 nm； 进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备 精密称取对照品异嗪皮啶1.0 mg、迷迭香酸1.5 mg， 置于25 mL 量瓶中， 甲醇稀释至刻度，摇匀， 即得（线性关系考察用）。 再精密称取2 种对照品适量， 置于25 mL 量瓶中， 甲醇稀释至刻度， 即得（两者各含10 μg／mL， 加样回收率试验用）。

2.3 供试品溶液制备 精密称取颗粒粉末1.0 g， 置于100 mL具塞锥形瓶中， 加入50 mL 甲醇， 水浴加热回流1 h，放冷， 摇匀， 0.45 μm 微孔滤膜滤过， 取续滤液， 即得。

2.4 阴性样品溶液制备 按处方比例制备缺肿节风的阴性样品， 按“2.3” 项下方法制备， 即得。

3 结果

3.1 专属性试验 取对照品、 供试品、 阴性样品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 结果见图1。 由图可知，异嗪皮啶、 迷迭香酸均与相邻峰的分离度良好（＞1.5），阴性无干扰。

3.2 线性关系考察 精密量取对照品溶液1、 2、 3、 4、5 mL， 置于10 mL 量瓶中， 甲醇稀释至刻度， 精密量取10 μL， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定。 以溶液质量浓度为横坐标（X）， 峰面积为纵坐标（Y） 进行回归， 得异嗪皮啶、 迷迭香酸回归方程分别为Y ＝28 658.43X ＋8 264.565（r ＝0.999 7）、 Y ＝27 783.65X-11 532.53 （r ＝0.999 7）， 分别在3.795 ～18.975、 6.035 ～30.175 μg／mL范围内线性关系良好。

3.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL， 在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次， 测得异嗪皮啶、 迷迭香酸峰面积RSD 分别为1.17%、 0.72%， 表明仪器精密度良好。

3.4 重复性试验 精密称取颗粒（批号20101201） 6 份，按“2.3” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 测得异嗪皮啶、 迷迭香酸含有量RSD 分别为1.2%、 1.15%， 表明该方法重复性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图

3.5 稳定性试验 精密称取颗粒（批号20101201） 1.0 g，按“2.3” 项下方法制备供试品溶液， 于室温下放置0、 2、4、 8、 12、 16、 24 h 后在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得异嗪皮啶、 迷迭香酸含有量RSD 分别为0.72%、0.71%， 表明溶液在24 h 内稳定性良好。

3.6 加样回收率试验 精密称取含有量已知的颗粒（批号20101201） 0.5 g， 平行6 份， 精密加入“2.2” 项下对照品溶液25 mL， 按“2.3” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 结果见表1。

3.7 样品含有量测定 取3 批颗粒， 按“2.3” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样10 μL 测定， 计算含有量， 结果见表2。

4 讨论

查阅2015 年版《中国药典》 一部发现， 肿节风含有量测定项下的检测波长为342 nm， 为异嗪皮啶最大吸收， 而迷迭香酸最大吸收波长为330 nm。 本实验发现， 在330 nm波长下2 种成分均有灵敏度高的较强吸收， 故选择其作为检测波长。

表1 各成分加样回收率试验结果（n＝6）

表2 各成分含有量测定结果（n＝3）

肿节风三清颗粒是由肿节风、 射干、 甘草3 味药材经提取后加工制成， 成分较复杂。 前期曾按文献［10-11］ 方法检测异嗪皮啶、 迷迭香酸， 但杂质峰不能得到有效分离，本实验通过查阅大量文献结合《中国药典》， 对色谱条件进行反复探索优化， 最终确定“2.1” 项下条件。 同时，还验证该条件在不同品牌色谱柱、 柱温下的分离效果， 发现室温下各色谱柱均能将主峰与杂质峰有效分离， 而且峰形良好， 保留时间适中， 适用于该制剂含有量测定。

目前， 在人医临床上以肿节风的为主的药物制剂已得到广泛应用［12］， 有片剂、 口服液、 注射液等剂型， 其质量控制方法也较成熟， 而且研究人员对该药材大部分有效成分进行提取分离， 还深入考察有效部位在体内的作用机制和代谢过程， 为临床用药提供依据。 然而， 在兽医临床上肿节风浸膏及制剂的标准均未收载于兽药典， 表明其开发相对滞后。 本实验建立HPLC 法同时测定肿节风三清颗粒中异嗪皮啶、 迷迭香酸的含有量， 以期能促进相关兽药制剂标准的制订， 并充分发挥肿节风在兽医临床上的疫病防治作用。