外周血中clusterin和septin-9及CA125在卵巢癌患者中的表达及其意义

郭艳红 钟惠敏 周龙书

(广州医科大学附属第二医院妇科，广东 广州 510000)

卵巢癌是一种恶性程度高、治疗难度大的妇科肿瘤。受卵巢在体内所处的位置及卵巢癌的生物学特性的影响，卵巢癌的早期诊断比较困难[1]。因而，寻找卵巢癌早期发病的相关指标，对疾病的早期诊治及患者的预后有着积极意义。新近发现，clusterin和septin-9蛋白可能与卵巢癌的发病存在一定的相关性。其中，clusterin蛋白是一种抗凋亡蛋白，在多种器官和组织中均有表达。目前已发现，clusterin蛋白的高表达与肺癌、乳腺癌等有关[2]。编码septin-9蛋白的septin-9基因位于染色体17q25.3，亦被称之为ovarian/breast(Ov/Br)septin基因，目前认为其发挥了原癌基因的作用[3]。CA125是一项临床常用的肿瘤指标，对消化系统及妇科等肿瘤具有较高的敏感性。笔者拟在传统肿瘤指标CA125基础上联合clusterin和septin-9基因/蛋白的检测，以分析其与卵巢癌患者早期诊断及预后判断的相关性。现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择我院妇产科2016年5月至2018年1月收治的明确诊断为卵巢癌的患者62例为观察组。另选择同期健康体检者31例为对照组。观察组年龄35～48岁，平均(41.25±6.28)岁；FIGO分级Ⅰ～Ⅱ期的患者共33例；Ⅲ～Ⅳ期的患者29例；其中未分化者5例，低分化者28例，中分化者10例，高分化者19例；发生远处转移者22例，无远处转移者40例，发生淋巴结转移者21例，未发生淋巴结转移者41例。对照组年龄35～49岁，平均(41.62±6.64)岁。纳入标准：经病理证实为卵巢癌并采用国际妇产科联合会(FIGO)分期；未接受化疗、放疗及生物治疗等；预计生存期≥6个月。排除标准：卵巢转移性癌；合并其他系统恶性肿瘤者。两组患者基线资料间未见明显差异(P>0.05)，具有可比性。

1.2试剂与方法

1.2.1试验试剂及仪器 试剂：Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司)、RNA提取试剂盒(购自德国Miltenyi Biotec公司)、逆转录和PCR试剂盒(均购自美国 Invitrogen 公司)、引物合成(上海生工公司)、人clusterin ELISA试剂盒(购自美国LIFEKEY公司)、人septin-9 ELISA试剂盒(购自美国ABNOVA公司)、CA125采用化学发光法检测。仪器：ABI 7300型实时定量荧光PCR仪。

1.2.2方法 (1)抽取患者外周血于4℃条件下，1 500 g离心力下离心15 min，取上层血浆分装保存于-80℃冰箱以备用。(2)采用qRT-PCR方法检测基因表达水平采用TRIZOL试剂提取总RNA。采用逆转录试剂盒合成cDNA。以β-catin为内参基因，采用ABI 7 300型PCR仪将转录成的cDNA在50℃、2 min，95℃、15 min，95℃、15 s，60℃、1 min，共40个循环条件下扩增。每次循环均设空白对照，计算目的基因 mRNA的相对表达量，每组重复 3 次取均值。PCR产物采用2%琼脂糖凝胶电泳分析并鉴定。基因相对表达量采用△△Ct法进行计算，△△Ct=(Ct目的基因-Ctβ-catin)观察组-(Ct目的基因-Ctβ-catin)对照组，观察组标本相对表达量为2-△△Ct。引物序列见表1。(3)按照ELISA试剂盒说明书，分别检测血浆中clusterin和septin-9蛋白水平。

表1 引物序列

2 结 果

2.1两组患者clusterin和septin-9 mRNA表达水平比较 经过检测显示，观察组患者外周血中clusterin和septin-9 mRNA相对表达量分别为(1.67±0.81)、(1.93±0.22)；外周血中clusterin和septin-9 蛋白相对表达量分别为(133.26±16.31)、(633.29±28.61)。与对照组相比，观察组患者外周血中clusterin和septin-9 Mrna/蛋白表达量均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2两组患者外周血CA125表达水平比较 与对照组(37.91±11.84) kU/mL相比，观察组患者外周血中CA125表达量(279.36±36.14) kU/mL显著升高(t=5.338，P=0.011<0.05)。

2.3外周血clusterin、septin-9及CA125表达水平与疾病相关性 分别比较不同病理分期、是否远处转移(包括淋巴结转移)及不同分化程度患者间clusterin、septin-9及CA125表达水平发现：Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者与Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者相比，clusterin基因/蛋白及CA125水平显著降低(P<0.05)，而septin-9基因/蛋白表达水平间未见明显差异；未发生远处转移(包括淋巴结转移)者较发生远处转移(包括淋巴结转移)者，其septin-9基因/蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，而clusterin基因/蛋白及CA125间未见明显差异；不同分化程度患者间clusterin、septin-9及CA125表达水平均未见明显差异。见表2。

表2 不同病理分期、是否远处转移及不同分化程度患者间clusterin、septin-9及CA125表达水平差异

3 讨 论

卵巢癌是妇女第五常见的恶性肿瘤。卵巢恶性肿瘤死亡率居高不下的原因主要在于约占卵巢原发恶性肿瘤总数80%～90%的卵巢上皮性癌在早期时症状不明显，没有有效的早期筛查手段，临床上早期难以发现，发现时常常已经是晚期，而晚期卵巢癌即使经过规范化治疗，在治疗后3年内多数仍会出现复发、转移和耐药，患者预后很差，5年生存率仅为20%左右[4-6]。因此，寻找早期的诊断指标对卵巢癌患者的诊断、治疗及远期预后具有重要意义。传统的肿瘤指标主要包括糖类蛋白等，其中CA125对消化系统及妇科系统来源肿瘤具有较高的他特异性，但在疾病早期缺乏敏感。相关指标明显升高时，往往原发病已显著进展。因而，单纯依靠现有的肿瘤监测指标远不能满足包括卵巢癌在内的恶性肿瘤性疾病的诊治需求。

septin-9定位于染色体17q25.3，是体内重要的原癌基因之一[7]。体外研究[8-9]发现，在人细胞系的AffymetrixHG U133基因芯片检测结果表明，septin-9在乳腺、中枢神经系统、子宫内膜、肾脏、肝、肺、淋巴、食管、卵巢、胰腺、软组织、皮肤、甲状腺等来源的肿瘤中高表达。clusterin基因定位于染色体8p21-p12，其编码的蛋白参与了多种重要生理功能，包括精子成熟、膜再生、脂类转运、组织分化和重塑、补体抑制、细胞．细胞及细胞．细胞外基质相互作用、炎症、细胞运动、分子伴侣、细胞氧化应激、细胞增殖、细胞凋亡等[10-15]。近年来研究[16-18]发现，clusterin除作为胞外分子伴侣发挥使应激性蛋白变稳定的作用外，也是一种凋亡相关蛋白，参与到细胞程序化死亡过程中，该蛋白在肿瘤性疾病的发生、发展过程中可能起到一定的促进作用。然而有关septin-9/clusterin基因及其转录的蛋白水平与卵巢癌发生及进展过程是否相关，相关报道较少。本组资料中，在观察组患者中septin-9及clusterin基因/蛋白表达的水平较对照组显著升高，提示这两种基因/蛋白可能参与了卵巢癌发病过程，在进一步的分析中发现，病理分期晚期的患者中，其clusterin基因/蛋白及CA125表达水平较早期患者显著升高，提示clusterin联合CA125检测对早期卵巢癌的诊断具有一定的意义。而通过对原发肿瘤转移情况分析发现，septin-9基因/蛋白在发生远处转移的患者中明显升高，这表明septin-9的高表达可协助提供肿瘤进展的证据。

综上所述，卵巢癌患者外周血中clusterin、septin-9及CA125水平较正常人群均显著升高，其中clusterin和CA125表达增高者可能提示病理分期较高，septin-9表达增高考虑存在原发病的远处转移可能。然而，受到样本量等客观因素的限制，数据偏倚在所难免，相关因素的长期作用尚需进一步研究。