病毒性心肌炎患儿外周血中心功能、心肌酶谱指标、核因子-κB表达量的变化及核因子-κB与病情的相关性研究

丁小芹 汪秋春 曾火明 何爱军

(湖北省孝感市中医医院儿科，湖北 孝感 432000)

病毒性心肌炎(viralmyocarditis，VMC)是患者心肌被嗜心性病毒感染，致使心肌或者其相关间质的弥漫性或局灶性炎症[1]。并以单核-巨嗜细胞及心肌间质淋巴细胞浸润为主要的病理学特征，同时伴有一定程度的邻近心肌细胞坏死或变性，是小儿心血管科较为常见的一种心血管疾病[2]。由于VMC没有典型的临床特征，通常难以引起人们的关注，当患儿的心脏传导阻滞被感染波及时，可造成患者骤然死亡[3]。研究[4]显示，婴幼儿VMC患者的病死率高达50%左右，且儿童VMC患者的预后相对较差，瑞典卫生机构的调查显示，VMC疾病的猝死比例已经占有10%左右，严重危及患儿的健康及预后生活质量。而NF-κB是一种基因转录调节的关键性因子，参与炎症反应相关的基因应答及机体防御功能的调控，与VMC患儿的病情关系密切[5]。故本文探讨VMC患儿外周血中NF-κB表达量的变化及其与病情的相关性，为VMC患儿的临床诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择我院2016年3月至2018年3月收治的VMC患儿106例作为研究对象，根据病情将其分为休克组、心衰组和无心衰组，并取同期我院门诊外科32例患儿作为对照组。其中对照组患儿的心电图、胸透以及血象较为正常，且近期无感染，其中男18例，女14例，年龄1～12岁，平均(7.26±3.04)岁。休克组15例，其中男8例，女7例，年龄1～13岁，平均(6.87±3.12)岁；心衰组28例，其中男16例，女12例，年龄1～13岁，平均(6.76±3.21)岁；无心衰组63例，其中男34例，女29例，年龄1～12岁，平均(6.94±3.32)岁。诊断标准：参考1999年全国心肌病以及小儿心肌炎学术会议制定的《小儿病毒性心肌炎诊断标准》[6]，具体如下：(1)临床诊断依据：心脏扩大；心脏综合征、心源性休克及心功能不全；心肌肌钙蛋白或者CK-MB阳性；以R波为主的ST-T持续性改变并伴有动态变化，房室、窦房传导阻滞，完全左束或右束支传导阻滞，呈现成对、多源、多型、成联律。异常Q波及低电压。(2)病原学诊断依据：患儿血液中探查到病毒核酸；早期有特异性IgM抗体阳性出现；血压、粪便中分离到病毒，与第1份血清相比，恢复期血清降低4倍以上或者一定程度升高。确认指标，可将病毒自心包、心肌、心内膜或者心包穿刺液中分离出来；特异性病毒抗体呈阳性；患儿血液中探查到病毒核酸。(3)判断标准：至少具有2项以上的临床诊断依据，且有一定的病毒感染支持，同时具有1项病原学参考依据，即可诊断。纳入标准：(1)符合上述诊断标准者；(2)首次患病，且年龄≤14岁；(3)此研究经本院医学伦理委员会批准；(4)家属签署知情协议书。排除标准：(1)伴有先天性心脏病者；(2)伴有急性传染性疾病；(3)伴有严重的肝肾功能障碍者；(4)临床资料不完整；(5)依从性差，中途退出者。分组标准：文中根据患者的临床体征及症状，将VMC患者分为休克组、心衰组和非心衰组。其中休克组：患儿通常骤然起病，呈现爆发性经过，并以无尿、收缩压60～80 mmHg、舒张压0～40 mmHg、肢体发凉、皮肤湿冷、奔马律、脉搏细速、面色苍白等为主要休克表现，动态心电图往往出现心动过缓、室颤、完全性房室传导阻滞，超声检查心功能明显下降。心衰组：参考第7版《实用儿科学》[7]中相关规定，存在少尿、双下肢浮肿、肝脏增大、奔马律、呼吸心率增快、循环充血、无其他诱因的烦躁，超声显示为心包积液以及心脏扩大等改变，X线显示心博减弱，胸片显示患者心影扩大，动态心电图显示患者存在较为严重的心律失常，同时伴有一定程度的传导系统以及其他系统损伤。(3)无心衰组：存在短阵房速、结性早搏、室早、房早、心电图ST-T波改变、较轻病症或者其他非特异性症状，另外还具有一定的心动过速、精神不好，多数患儿在数周或者数日内即可痊愈。

1.2方法

1.2.1心功能指标测定 在所有患儿入院24 h内，由同一专门的经验丰富的影像科医师，采用彩色多普勒超声诊断仪(ACUSON S2000；德国西门子)对患者的射血分数(EF)、左室短轴缩短率(LVFS)、左房内径(LAD)及左室收缩末期内径(LVESD)进行测定。

1.2.2血清心肌酶谱测定 于患儿入院次日清晨8～10时，抽取其5 mL的空腹静脉血，通过离心机(Ortho BioVue；强生(上海)医疗器材有限公司)在离心半径为10.5 cm、转速3 000 r/min条件下，离心10 min，取其上清液，冰箱-75℃保存。采用酶联免疫吸附法测定患儿血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酸激酶(CK)水平，试剂盒购于北京丹大生物技术有限公司，操作方法严格按照说明书进行。

1.2.3外周血中NF-κB表达水平测定[8-9](1)单核细胞的标记：于患儿入院次日清晨8～10时，另抽取其5 mL的空腹静脉血，加入肝素钠进行抗凝处理；将2.5 mL经过PE-Cy5标记的鼠抗人CD14单抗(上海远慕生物科技有限公司)加入到加样管中，再将上述经过抗凝处理的100 μL血加入其中，振摇，进行20 min的避光反应。(2)单核细胞的固定：根据FIX&PERM试剂盒(联科生物技术有限公司)中的有关说明，在加样管中加入Fixation Medium A 100 μL进行固定处理，并在避光条件下进行15 min的反应，之后在加入PBS 2 mL，离心机在离心半径为10.5 cm、转速1 500 r/min条件下，离心5 min，弃去上清液。(3)单核细胞的破膜及免疫荧光抗体染色处理：根据上述试剂盒说明书操作规程，破膜处理需将Permeabilization Medium B 100 μL加入到加样管中，之后在检测管中加入5 μL NF-κB P65单抗(经PE标记)IgG同型免疫球蛋白单抗(安必奇生物科技有限公司)，在对照管中加入5 μL小鼠抗人NF-κB P65单抗(经PE标记)。振荡摇匀，避光条件下，进行20 min的反应，将PBS 2 mL加入到其中，离心机在离心半径为10.5 cm、转速1 500 r/min条件下，离心5 min。弃去上清液，将500 μL的生理盐水加入其中，充分振荡均匀，最后采用上流式细胞仪(Gallio型；贝克曼库尔特)对其NF-κB表达水平进行测定。

2 结 果

2.1不同病情患儿心功能指标比较 对于VMC患者，按照无心衰组、心衰组及休克组的等级分组顺序，其EF异常率、LVFS异常率、LAD及LVESD值均明显升高，且均明显高于对照组(P<0.05)。

表1 不同病情患儿心功能指标比较

注：与对照组相比，*P<0.05。

2.2不同病情患儿血清心肌酶谱指标比较 对于VMC患者，按照无心衰组、心衰组及休克组的等级分组顺序，其ALT、AST、LDH、cTnI、CK-MB及CK水平均明显升高，且均明显高于对照组(P<0.05)。

表2 不同病情患儿血清心肌酶谱指标比较

注：与对照组相比，#P<0.05。

2.3不同病情患者的外周血中NF-κB表达水平比较 对于VMC患者，按照无心衰组、心衰组及休克组的等级分组顺序，其外周血中NF-κB表达水平明显升高，且均明显高于对照组(P<0.05)。

表3 不同病情患者的外周血中NF-κB表达水平比较

注：与对照组相比，△P<0.05。

2.4VMC患儿外周血中NF-κB表达水平与其病情分组等级相关性分析 VMC患儿外周血中NF-κB表达水平与VMC患者分组呈现等级正相关(r=0.641，P<0.05)。

3 讨 论

VMC是一种临床常见的儿科心血管疾病，也是新生儿患儿致死的主要原因之一，严重危及患儿的生命健康。由于VMC所引起的儿童心源性猝死率升高，逐渐受到医护工作者的高度重视。目前临床上对于其发病机制尚未有权威性解释，但一般认为与病毒感染所致的免疫损伤及心肌损伤有关[10]。由于超声心动图可以对患者心腔功能及大小进行直观的显示，可以对心肌结构功能病变进行预测。其中EF和LVFS是对患者左心室收缩功能评价最为常用的指标；LVESD是反映其左室收缩功能及收缩末期大小的指标；LAD是一种可以判断心脏扩大与否的重要指标[11]。本文中结果提示VMC患者容易累及其左室收缩功能，心脏扩大，收缩功能下降，按照无心衰组、心衰组及休克组的顺序，其病情逐渐加重。另外，心肌酶谱指标是可以反映VMC患儿心肌损伤程度的指标，其中ALT、AST、LDH、cTnI、CK-MB及CK是最为常见的几种心肌酶谱指标，也可以相应地反映患者病情的严重程度[12]，文中结果提示VMC患者病情越重，其心肌损伤程度相对越重。

NF-κB是Baltimore和Sen于1986年发现的一种存在于人体各种细胞胞浆中的重要转录因子，同时也是诸如急性期反应蛋白、黏附因子、炎症介质、生长因子、免疫受体、转录因子及促炎因子等高表达所必需的转录因子，在VMC疾病的发生及进展过程中作用显著[13]。而正常情况下，NF-κB在人体静止细胞的细胞质中以两种无活性的状态存在(与其前提p105或p100相结合；与IκB相结合)，在受到前炎症因子等多种因素的诱导下，进行活化，诱导诸如因子的转录[14]。文中结果显示，随着VMC病情的加重，患儿外周血中NF-κB表达水平逐渐升高，两者呈现等级正相关，故认为NF-κB是一种可以反映VMC患者病情严重程度的敏感指标。这可能是由于机体内部的细胞因子在VMC疾病病毒诱发、自身免疫反应以及病情进展过程中，具有一定的作用[15]。而NF-κB广泛存在于患者细胞胞浆中，可以促进多种细胞因子的表达，调控VMC患者急性炎症的发生及进展过程[16]。细胞中NF-κB在嗜心性病毒的感染诱导下，进入细胞核内部，对IL-1、TNF-α等原发性炎性介质基因的表达进行调控，从而进一步促进更多的继发性细胞介质及因子被巨嗜细胞产生[17]。总之，NF-κB主要是通过对酶类、化学因子、炎性因子以及粘附分子等细胞介质及因子的转录表达进行诱导影响而发挥作用[18]。反过来，大量促炎介质的表达也会进一步对NF-κB进行激活，进而形成级联放大效应，加重病情的发展恶化[19]。而Z.Cheng等[20]通过对小鼠模型进行研究发现，INF-γ、TNF-α、IL-1等mRNA的表达水平升高，而TNF-α为心肌炎症反应中较为重要的炎症因子，可以对无活性的IκB进行降解，进而激活NF-κB，造成心肌损伤、凋亡甚至坏死，加重病情，也证实了本文的观点。

综上所述，VMC患儿外周血中NF-κB表达水平与VMC患儿分组呈现等级正相关，可以作为VMC患者病情程度判定的重要参考指标。