基于公共基因芯片的多农药代谢相关的拟南芥UGT基因挖掘

吴 凡,贾晓晨,赵小明,尹 恒

(1.中国科学院大连化学物理研究所,辽宁省碳水化合物研究重点实验室,辽宁大连 116023;2.中国科学院大学,北京 100049)

农药的使用已成为防治植物病虫害、去除杂草、调节农作物生长及提高农产品产量和质量的重要措施。然而，化学农药的大量使用，常常引发农作物药害并导致高超标的农药残留，直接危害人类健康和生存环境。因此，寻找有效、经济、环保的农药降解方法对实现农作物高效、安全生产和发展可持续农业具有重要意义。

尿苷二磷酸糖基转移酶(UGT)是植物4相代谢解毒过程中第2阶段的关键家族之一，能够糖基化修饰多种官能团，降低或去除外源物质毒性，对多种外源毒物均有代谢能力，例如农药、微生物源的植物毒素、环境污染物等[1-2]。研究表明拟南芥中大约40%的UGT能够参与异源物质的结合反应，主要归属于D、E、H和L类群，并且体外试验证明其中的13个UGT基因能够同时对羟基、巯基、氨基表现出活性[3-4]，UGT基因的广谱结合能力得到证明。UGT参与农药代谢的功能已有相关报道，例如：体外试验证明拟南芥的UGT72B1对2种污染物3,4-二氯苯胺(DCA)和2,4,5-三氯苯酚(TCP)具有高度的结合活性，敲除UGT72B1后对TCP和DCA的结合活性显著下降[5]。进一步研究证实UGT72B1具有O-糖基化和N-糖基化的双功能催化活性[6]。拟南芥中的UGT72E1、UGT75B1、UGT75D1、UGT84A1、UGT84A2、UGT84B1经体外试验证明均能代谢外源TCP[7]。并且，Edwards等[8]通过体外试验证明糖基转移酶(Glucosyltransferase，GT)的表达还会受到除草剂安全剂的诱导，在小麦、玉米和拟南芥中，使用多种除草剂安全剂后，GT对TCP和DCA的活性相对于对照组均增强了10倍。尽管植物来源的UGT基因的杀虫剂代谢功能未见报道，但小菜蛾中的UGT2B17能够提供对氯虫苯甲酰胺的抗性，该基因被RNA沉默后，毒性作用显著增强[9]。因此，UGT不仅参与农药代谢，并且具备广谱的底物结合能力，但对具备广谱农药代谢能力的UGT基因鲜有研究。

目前，关于UGT家族在农药代谢中的应用研究依然较少，而且由于农业环境的复杂性，往往会同时存在多种农药残留，因此研究具备广谱糖基化功能的UGT家族具有重要意义。此外，UGT作为自然界中最大的功能酶家族之一，其数量庞大，难以通过生物化学试验快速有效地鉴定出具有这种特性的UGT基因。近年来发展起来的各种高通量测序手段如Microarray和RNA-sequence，均能快速反映出试验对象对处理条件的响应，提供了一个强有力的手段来分析预测基因的生物学功能。

因此，本研究利用NCBI中的基因表达综合数据库(GEO)公共数据库进行拟南芥基因芯片的筛选，采用差异表达分析、聚类分析及共表达分析等多种生物信息学的分析手段对拟南芥中的UGT基因进行研究，为探索植物中具备广谱糖基化农药的UGT基因提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在NCBI的GEO数据库中筛选并收集关于农药与除草剂安全剂的66个样本数据，所有样本都基于GPL198平台。芯片信息经处理后，其对比试验注释如表1所示。

表1 对比试验注释表Table 1 Annotation of comparative experiments

1.2 差异表达分析

编写一份R语言脚本使用Bioconductor limma函数包中的Empirical Bayes方法进行基因的差异表达计算，选择以| log2(Fold change)(简称logFC)|>=1，作为显著差异阈值。

1.3 热图分析

本研究使用R语言中的pheatmap函数包制作热图。对UGT基因聚类距离的计算采用欧氏距离。

1.4 相关性

使用皮尔森相关系数(Pearson correlation coefficient，PCC)计算基因间的相关系数，设定显著性阈值为0.8。为排除不同试验的背景差异，使用logFC向量计算基因间的相关系数。

1.5 GO分析

使用DAVID (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)进行在线GO分析，富集的显著性阈值为P<0.01。

1.6 构建共表达网络

编写一份R语言脚本获取UGT基因的相关基因，构成共表达网络的结点(基因)集合。计算所有UGT基因的相关基因间的相关性，设置PCC阈值为0.8以产生基因关联(边)，使用Cytoscape[10]构建共表达网络。

2 结果与分析

2.1 拟南芥UGT的表达谱分析

首先，依照注释信息对拟南芥106条UGT基因的表达谱进行分析，其结果如图1所示。结果表明，UGT家族受到农药诱导后发生强烈的转录重编程(图1-A)，暗示UGT家族在农药代谢中的重要作用。聚类结果显示，UGT73C1、UGT73B4、UGT73B5、UGT73C6、UGT73B2、UGT76B1、UGT87A2和UGT74E2在多种农药处理中均高度上调，其平均上调倍数如表2所示，其中UGT74E2的转录上调高达26.25倍(表2)。Edwards等[8]对拟南芥UGT家族的底物选择性研究发现，UGT73C1、UGT73B1、UGT73B2、UGT73B4和UGT73B5能够糖基化含有羟基或巯基的一种或多种底物，佐证了本研究中候选基因的广谱结合能力。在收集的芯片数据中，所采用农药的结构存在明显差异，包含多种末端基团，其结构更为复杂，暗示这8个UGT基因具有广泛的底物选择性，具有更重要的研究价值，是多农药代谢相关的关键候选UGT基因。

A.拟南芥106条UGT基因在8种农药处理前后的转录水平变化,方框内标记的为8个候选UGT基因 Transcriptional fold-change of 106 UGTs in 8 kinds of pesticides,respectively, UGTs in the box are candidates to metabolize multiple pesticides; B. 8个候选UGT基因在5种不同的安全剂处理条件下的转录水平变化,每一个单元格内的数字代表该基因的logFC值 Transcriptional fold-change of 8 key UGTs in 5 kinds of safener treatments,the number in each cell represents logFC value

图1 拟南芥UGT的表达谱分析Fig.1 Analysis of UGT expression profiles in Arabidopsis thaliana

除草剂安全剂可增强作物对除草剂的代谢能力，是目前最受关注和普遍认同的一种机制，并且一般认为仅改变除草剂的代谢速率，而不改变其代谢途径，其中受到诱导的基因也包括糖基转移酶[11-12]。因此，笔者收集了NCBI中有关除草剂安全剂的基因芯片数据进行表达谱分析，其结果如图1-B所示。候选UGT基因在不同的除草剂安全剂中，转录水平均受到强烈的诱导上调，这进一步证明了候选UGT基因参与了解毒过程。

2.2 候选UGT与植物解毒过程的相关性

共表达基因是指在多种外界条件下，这些基因的表达均表现出高度的相关性，具有更大的可能性参与相同的生物学途径或生物学功能[13]。因此，通过UGT基因的共表达基因功能可以对UGT的功能进行探索。通过计算候选UGT基因与全基因组基因的相关性，筛选得到772个高度相关的基因，对这个基因集合进行GO富集分析。结果如图2所示，在生物学过程分类中，共表达基因主要富集于谷胱甘肽代谢过程、毒性催化过程、响应毒性底物、响应镉离子等；在细胞组分分类中，共表达基因主要存在于胞浆，蛋白酶体复合物，过氧化物酶体，液泡膜中；按分子功能分类，这些基因主要具有谷胱甘肽转移酶活性和反向转运体活性。植物解毒过程通常是经过活化反应(CYP450家族等)、结合反应(UGT家族、GST家族等)和区室化反应(ABC转运蛋白家族)共同完成，最终异源毒物交联物会在液泡中等待进一步的代谢反应。共表达基因富集的分子功能、生物学过程以及细胞定位均与植物的解毒过程高度重叠，表明候选UGT与其他解毒酶系构成完整的4相代谢解毒过程，以完成对农药的解毒作用。

a.谷胱甘肽代谢过程 Glutathione metabolic process；b.毒素分解过程 Toxin catabolic process；c.响应毒性底物 Response to toxic substance；d.响应镉离子 Response to cadmium ion；e.三羧酸循环 Tricarboxylic acid cycle；f.氧化还原过程 Oxidation-reduction process；g.药物跨膜运输 Drug transmembrane transport；h.细胞质 Cytosol；i.蛋白酶体复合物 Proteasome complex；j.过氧化物酶体 Peroxisome；k.液泡膜 Vacuolar membrane；l.谷胱甘肽转移酶活性 Flutathione transferase activity；m.逆向转运活性 Antiporter activity

图2拟南芥候选UGT共表达基因的GO富集分析
Fig.2GOenrichmentanalysisofco-expressiongenesof8keyUGT

2.3 共表达网络揭示解毒过程的关键基因

为了进一步探索UGT基因与其共表达基因之间的联系，笔者将候选UGT基因及共表达基因的相关关系以网络图的形式呈现(图3)。网络图中共包含780个结点(基因)，PCC大于0.8的结点间会形成一条边。在网络图中，对植物4相代谢过程中重要的功能酶家族进行标记。网络中包含的解毒第1阶段代谢酶系主要有2OG加氧酶超家族、细胞色素P450超家族及alpha/beta水解酶超家族等；第2阶段代谢相关酶系包括除候选基因以外的UGT超家族、谷胱甘肽转移酶超家族及SAM甲基转移酶超家族等；第3阶段相关酶系主要是ABC转运蛋白超家族。目前，4相代谢前3个阶段中的关键酶系已经得到大量的研究，但第4个阶段涉及到异源物质偶联物在液泡或胞质的进一步代谢，还不具备代表酶系[14-15]，因此未予标记。共表达网络显示，8个候选UGT基因之间是直接相连或间接相连，证明了这些UGT基因之间也具备高度的相关性。

桥接多个候选UGT的基因同样具有重要作用，部分基因的解毒功能已经明确。例如，GSTU24在网络图中与4个候选UGT基因相关，能够催化TNT脱硝并且形成谷胱甘肽交联物[16]。PMAT1基因在网络中同时与5个候选UGT基因相关，编码丙二酰转移酶，尽管一般认为丙二酰转移酶系在植物解毒第2个阶段发挥作用，但目前有研究表明烟草PMAT1能够丙二酰化多种酚类糖苷，并且其表达水平与酚类糖苷的体外排出与液泡储存直接相关[17]，暗示PMAT1参与了异源物质的代谢解毒的第4阶段。ABCC4与3个候选UGT相关，虽然没有直接的证据表明拟南芥来源的ABCC4能够参与农药代谢，但是斑马鱼来源的ABCC4基因有助于多种农药的排出[18-19]。这些桥接节点不但本身具备重要的解毒功能，并且还进一步的暗示候选UGT基因参与植物的农药代谢过程。此外，在共表达网络中，UGT73B4和UGT73B5的共表达基因集合中含有最丰富的植物解毒相关酶，暗示了这2个UGT基因的底物更为广泛，是参与广谱农药代谢的关键UGT基因。

图3 由8个候选的UGT及其相关基因构建的共表达网络Fig.3 Co-expression network of 8 key UGTs and their co-expression genes

3 讨 论

农药残留问题直接威胁到人类健康与生存环境，寻找一个绿色环保的解决方案是目前研究的热点。植物在对抗异源物质的过程中，进化出了一套复杂的解毒系统，能够代谢大量的外源物质，包括微生物源的植物毒素、异种化合物、污染物以及农药等[20]。如何利用植物自身的解毒功能完成农残降解或者开发新型安全剂等具有广泛的应用前景。同时，在植物的解毒过程中，最广泛存在的异源物质结合过程是利用UDP-葡萄糖作为供体形成结合物，该过程的代表是UGT家族。因此笔者以此为出发点，试图找出具备广谱农药代谢能力的UGT基因。

本研究收集公共基因芯片数据，通过表达谱分析在拟南芥的UGT家族中筛选出8个候选UGT基因，可能具备广谱农药代谢能力。对这些候选UGT基因的共表达基因进行GO富集分析，结果表明这些基因参与的生物学途径最富集于谷胱甘肽代谢过程、催化和响应毒性物质中，分子功能则主要具有谷胱甘肽转移酶(GST)活性。谷胱甘肽中半胱氨酸上的巯基为其活性基团，能够在谷胱甘肽转移酶的催化下与毒性物质交联，从而转化成无毒物质，在许多异源物质的脱毒中起到至关重要的作用[6]。GST在农作物针对除草剂代谢中有广泛的报道，Milligan等[21]将玉米GST27导入小麦中，表现出对甲草胺、二甲酚草胺和扑草灭的抗性。水稻的GSTU3对酰胺类除草剂具有显著的脱毒作用[22]。GO富集分析的结果显示，候选UGT基因与GST等重要的解毒酶系共同参与解毒过程，暗示了这些UGT基因的农药解毒活性。进而，共表达网络不但显示UGT73B4和UGT73B5是广谱农药代谢的关键基因，还揭示了一批与植物解毒相关的重要基因。在网络中，与多个候选UGT相关的基因通常也具备农药代谢能力，例如，有研究推测沿烟草PMAT1可能涉及到异源物质的代谢调控[17]，共表达网络为PMAT1基因参与农药代谢提供了新的依据，其与5个关键的UGT基因存在高度相关性。

本研究利用公共数据库的基因芯片数据，对拟南芥糖基转移酶1家族进行了农药代谢相关的整体生物信息学分析与验证，为解决农业上的农药残留问题提供了参考，为新的农药解毒剂或安全剂研发提供依据，为拟南芥UGT基因下一步的生理学和毒理学研究奠定基础。