砧木对‘赤霞珠9’葡萄果实发育及隐色 花色素还原酶基因表达的影响

张付春，杨 坚，潘明启，郭春苗，钟海霞，周晓明，王 敏

(1.新疆农业科学院 园艺作物研究所/农业部新疆地区果树科学观测试验站， 乌鲁木齐 830091; 2. 昌吉州林业局，新疆昌吉 831100)

葡萄中含有大量具有保健作用的生理活性物质，目前，已明确其生理活性效果大多与单宁类化合物相关[1-2]。新疆是中国最大的葡萄产区，截至2016年底，酿酒葡萄栽培面积达到3.73万hm2，由于受新疆气候、水土等因素影响，新疆产区酿酒葡萄果实单宁化合物含量偏低，难以满足优质葡萄酒生产要求，单宁含量偏低成为影响新疆产区酿酒葡萄品质的主要指标之一，因此，新疆产区酿酒葡萄果实单宁的调控亟待研究。研究表明，砧木影响葡萄果实酚类物质以及相关酶活性，对接穗果实花青素、黄酮醇、黄烷-3-醇、原花青素、对称二苯代乙烯、羟基肉桂酸和对羟基酸均能产生影响[3]，对PAL(苯丙氨酸氨解酶)、CHI(查尔酮异构酶)、UFGT(类黄酮葡糖苷转移酶)3个酶活性产生影响[4]，选用砧木嫁接栽培葡萄已逐渐受到国内重视，已有研究表明砧木对葡萄果实单宁合成和积累具有明显的调控作用[5]。

隐色花色素还原酶(Leucoanthocyanidin reductase，LAR)专一性催化 2R、3S、4S-黄烷-3，4-二醇还原生成 2R、3S-黄烷-3-醇[6]，与花色素合成酶(ANS)、花色素还原酶(ANR)共同启动葡萄果实原花色素(Proanthocyanidins)的生物合成[7]，是葡萄果实单宁生物合成的关键酶之一。而包括隐色花色素还原酶在内的所有参与生化反应的酶的合成、活性调节都是由基因控制的[8]。研究表明，葡萄果实中多酚类物质生物合成和积累受环境条件调控[9]，如温度[10]、紫外线[11-13]、水分[14-17]等。但遗憾的是，有关砧木嫁接对葡萄果实原花色素生物合成和积累的作用鲜见报道，特别是砧木对隐色花色素还原酶时空积累的影响尚未见报道。

本试验以‘赤霞珠’(VitisviniferaL. cv. ‘Cabernet Sauvignon’)嫁接苗和自根苗果实为试材，用Trizol法，对果皮和果肉RNA进行提取和纯化，利用RT-PCR技术对果实隐色花色素还原酶(LAR)转录水平进行研究。阐明砧木对葡萄果实隐色花色素还原酶在果实中的分布、活性及原花色素时空积累的作用，揭示葡萄果实中该隐色花色素还原酶基因表达规律及砧木对其表达的影响，对于明确嫁接对葡萄果实品质及葡萄酒风味影响的生理和分子机制具有重要意义，同时为筛选优良葡萄砧木，进一步调控葡萄果实中原花色素含量、提高酿酒原料和葡萄酒品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 田间处理和样株的选择

试验在新疆农科院安宁渠试验场进行，选择抗寒砧木品种3个：‘5BB’(法国，冬葡萄与河岸葡萄的自然杂交后代)、‘101-14MG’(法国，美洲种群内种间杂交种)和‘SO4’(德国，冬葡萄和河岸葡萄杂交后代)，接穗品种：‘赤霞珠’(VitisviniferaL.cv ‘Cabernet Sauvignon’)；砧木于2011年5月定植，2012年5月下旬嫁接，2013年开始结果。砧穗组合处理：‘5BB’/‘赤霞珠’‘101-14MG’/‘赤霞珠’‘SO4’/‘赤霞珠’和‘赤霞珠’自根苗；选择管理方法、土壤和灌水条件以及砧穗生长势一致的植株，标记株号，每处理选择10株。

1.2 果实样品的采集和保存

分别于果实膨大期(花后40 d)、转色期(花后70 d)和成熟期(花后90 d、100 d)采样，共取样4次。选取生长基本一致的5～10株做为1个区组，共设3个区组。从每一区组中选取结果枝生长健壮、一致，果穗大小一致、着生方向相同的10～20个果穗，选取大小基本一致的外围无明显伤害、病虫害果实100粒，分离果皮和果肉后，液氮速冻，-70 ℃保存，备用。

1.3 果实理化指标的测定

花后40 d、70 d、90 d和100 d调查果果粒质量；观察并记录果实转色时间；果实成熟期称果粒质量，测量果蒂长度和粗度；通过排水法测定果穗体积和果粒体积，计算果穗松散度(果穗松散度=果穗体积/果粒体积)；秋季修剪时采集1 a生枝条第3节，测定枝条N、P、K、Zn、Cu、Fe、Mn质量分数。果实隐色花色素还原酶(LAR)活性参照温鹏飞等[18]的方法测定。

1.4 隐色花色素还原酶基因表达分析

按照Trizol一步法提取果皮和果肉中的总RNA，根据Gene Bank中葡萄LAR全长序列，利用Primer 5.0设计PCR扩增引物，由生物工程公司合成。以M-MLV为反转录酶，将mRNA反转录为cDNA。葡萄果实总RNA提取参照温鹏飞[19]方法进行，LAR基因表达分析采用Real-time PCR 法，参照Trans Script Ⅱ Green Two-Step qRT-PCR Super Mix 试剂盒操作说明进行。

2 结果与分析

2.1 不同砧木对‘赤霞珠’枝条矿质元素质量分数的影响

‘5BB’‘SO4’和‘101-14MG’均增加了枝条N素质量分数，‘5BB’较自根苗差异显著，分别为5.8 g/kg和3.4 g/kg，说明‘5BB’促进了N素的吸收，N作为大量元素是化肥的主要成分之一，‘5BB’砧木的利用对减少化肥使用有一定的实践意义；‘SO4’增加了‘赤霞珠’枝条P素质量分数，‘101-14MG’增加了‘赤霞珠’枝条K素质量分数；‘5BB’‘SO4’和‘101-14MG’降低了Fe元素质量分数，‘101-14MG’使枝条Mn元素质量分数上升，说明其促进了Mn元素的吸收(图1)。

Cs-1.赤霞珠9/5BB Cabernet Sauvignon 9 /5BB；Cs-2.赤霞珠9/SO4 Cabernet Sauvignon 9 /SO4；Cs-3.赤霞珠9/101-14MG Cabernet Sauvignon 9 /101-14MG；Cs-4.赤霞珠9自根苗 Cabernet Sauvignon 9 seedling；下同 The same below

图1‘赤霞珠9’砧穗组合枝条矿质元素质量分数
Fig.1Massfractionofmineralelementsin‘CabernetSauvignon’grapebranchesofanvilscioncombination

2.2 不同砧木对‘赤霞珠9’果实品质的影响

砧木‘5BB’‘SO4’嫁接‘赤霞珠’，增大了‘赤霞珠’葡萄果粒，‘5BB’使‘赤霞珠’果粒质量增加0.39 g，‘SO4’使‘赤霞珠’果粒质量增加0.34 g，‘101-14MG’使‘赤霞珠’果粒质量增加0.26 g(图2)；‘5BB’嫁接‘赤霞珠’在盛花后40 d转色，使‘赤霞珠’葡萄提前8 d转色，‘SO4’使‘赤霞珠’葡萄提前6 d转色，‘101-14MG’使‘赤霞珠’葡萄提前4 d转色(图2)；‘SO4’在增大‘赤霞珠’果粒的同时，拉长了果蒂长度，‘5BB’和‘101-14MG’对果蒂长度无明显影响(图3)，‘SO4’和‘5BB’增加了‘赤霞珠’果实果蒂粗度，‘101-14MG’略降低了果蒂粗度(图3)，‘SO4’降低了‘赤霞珠’果穗紧实程度，增加了果穗松散度(图3)。

图2 ‘赤霞珠9’砧穗组合果粒质量及转色时间变化Fig.2 Change of fruit mass and time of coloring of anvil scion combination

图3 ‘赤霞珠9’砧穗组合果蒂发育情况及果穗松散度Fig.3 Development of pedicel and loose degree of berry of anvil scion combination

2.3 不同砧木对‘赤霞珠9’ LAR活性的影响

由图4可知，在‘赤霞珠’整个果实发育期，各处理LAR活性呈现逐渐下降的趋势，这与温鹏飞[19]研究结果一致。在花后40 d、70 d、90 d和100 d 4个果实发育阶段，‘101-14MG’和‘SO4’嫁接‘赤霞珠’LAR活性始终大于‘赤霞珠’自根苗果实，‘5BB’在花后40 d和70 d，LAR活性与‘赤霞珠’自根苗LAR活性差异不大，花后90 d开始，LAR低于‘赤霞珠’自根苗果实，在花后100 d时，‘101-14MG’嫁接‘赤霞珠’LAR活性最强，其次分别是‘赤霞珠’/‘SO4’和‘赤霞珠’自根苗，‘赤霞珠’/‘5BB’LAR活性最低(图4)。

2.4 不同砧木对‘赤霞珠9’ LAR基因表达的影响

由图5可以看出，花后40 d、70 d、90 d和100 d不同发育阶段，果皮和果肉中LAR相对表达量总体呈现下降趋势，果肉中LAR相对表达量极小，果皮中LAR表达量显著高于果肉(图5)；花后40 d，‘101-14MG’嫁接‘赤霞珠’果实果皮中LAR相对表达量最大，其次是‘SO4’嫁接‘赤霞珠’，‘5BB’嫁接‘赤霞珠’和‘赤霞珠’自根苗LAR相对表达量差异不显著，随着果实的不断发育，4个处理间果皮中LAR相对表达量差异逐渐缩小；果肉中LAR相对表达量以‘101-14MG’嫁接‘赤霞珠’最大，并在40 d、70 d、90 d和100 d均显著高于其他3个处理，其次是‘SO4’嫁接‘赤霞珠’，‘5BB’嫁接‘赤霞珠’果肉LAR相对表达量略低于‘赤霞珠’自根苗，总体看，‘101-14MG’和‘SO4’嫁接‘赤霞珠’果皮和果肉中LAR相对表达量均大于‘赤霞珠’自根苗和‘5BB’嫁接‘赤霞珠’，其中‘SO4’嫁接‘赤霞珠’与‘赤霞珠’自根苗果皮和果肉中LAR相对表达量差异显著(图6)。

图4 不同发育期‘赤霞珠9’砧穗组合 果实LAR酶活性的变化Fig.4 Change of LAR activity of anvil scion combination during development of grape berry

图5 不同发育期和果实不同组织LAR表达Rt PCR 分析Fig.5 Analysis of expression of LAR during ‘Cabernet Sauvignon’ berry development and different parts by Rt PCR

3 讨 论

适宜的砧木利用不仅能提高接穗抗性，提高产量和品质，还对应对品种风险，减少经济损失具有重要意义，选择适宜的砧木是砧木利用取得成功的关键。本研究选取的3个砧木品种在国内已有一定的使用面积，但与接穗的适宜性研究较少，本研究中砧木‘5BB’具有长势旺盛、根系发达、入土深、耐旱、耐石灰性土壤等特点[20]，嫁接‘赤霞珠’后，使‘赤霞珠’葡萄枝条N素质量分数提高，果粒增大；砧木‘SO4’具有长势旺盛、根系发达、促进P素吸收等特点[20]，嫁接‘赤霞珠’后，使‘赤霞珠’葡萄枝条P素增加；砧木‘101-14MG’具有生长势中等、根系浅、促进早熟及促进K素吸收等特点[20]，嫁接‘赤霞珠’后，对果实膨大影响不大，使‘赤霞珠’葡萄枝条K素增加。

果穗的松散度影响果穗内部果粒的通风透光条件，进而影响果穗内部果粒的着色，坐果率和果粒数量不变的情况下，果蒂长度在一定程度上影响果穗的松散度，本研究中发现，‘SO4’砧木增大果蒂长度，果穗松散度较其他几个处理大，尤其比自根苗果穗更松散，不但对果穗内部果粒着色有利，而且在采后加工过程中更有利于脱梗。

图6 砧木嫁接对赤霞珠9果实不同组织LAR表达的Rt PCR 分析Fig.6 Analysis of grafting on expression of LAR in different parts of Cabernet Sauvignon berry development and by Rt PCR

在果实隐色花色素还原酶活性方面，在发育过程中总体表现为下降趋势，这与温鹏飞等[18]的研究结果一致，本研究的4个处理中，‘101-14MG’和‘SO4’使葡萄果实隐色花色素还原酶活性增强，‘5BB’作用不明显；葡萄隐色花色素还原酶(LAR)与苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查耳酮异构酶(CHI)、黄烷酮-3-羟化酶(F3H)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)、隐色花色素双氧化酶(LDOX)等共同参与单宁的生物合成[21]，在笔者团队前期研究中发现，‘101-14MG’和‘SO4’使‘赤霞珠’、梅鹿辄和霞多丽葡萄果实单宁质量分数升高，在本研究中，‘101-14MG’和‘SO4’使葡萄果实隐色花色素还原酶活性增强。

在果实隐色花色素还原酶基因表达方面，果实发育过程中的变化与果实隐色花色素还原酶活性表现出相似的趋势，即在发育过程中总体表现为下降趋势。‘101-14MG’和‘SO4’使葡萄果实隐色花色素还原酶基因表达量增加。从不同组织中的表达量来看，果皮中隐色花色素还原酶基因的表达量显著高于果肉中，与温鹏飞等[22]的研究结果一致。果实隐色花色素还原酶基因与花青素合成酶基因是葡萄果实单宁合成的特异基因，通过对以上2个基因的调控，可以改变葡萄果实单宁质量分数，对影响葡萄果实品质，尤其是对改善酿酒葡萄品质有重要意义，本研究中，‘101-14MG’可能对改善酿酒葡萄果实单宁质量分数有积极作用。

在砧穗互作机制方面，Cookson等[23]利用转录组测序研究了嫁接后嫁接部位上下的基因表达变化，发现在3 d和28 d的大量差异基因参与细胞壁修饰、伤口、激素信号和次级代谢等途径。Kim等[24]研究了‘康贝尔’早生葡萄(抗寒性较强)和‘巨峰’葡萄(抗寒性较差)的新梢在低温条件下的转录组变化，发现细胞过程(Cellular processes)初级代谢过程(Primary metabolic processes)和生理调节(Biological regulation)等生物过程跟‘康贝尔’早生的抗寒性密切相关。Vilvert等[25]对葡萄砧木‘SO4’(不抗病原菌)和‘8110’(抗病原菌)接种尖胞镰刀菌(Fusariumoxysporumf. sp.herbemontis)，以各自未接种作对照，发现植物防御蛋白在过程中起重要作用，其中‘8110’诱导产生了更多差异蛋白。以上研究说明高通量测序及组学分析己经成为研究砧穗互作机制的重要手段，通过转录组技术开展砧木对葡萄果实品质的影响机制是下一步研究的方向。

4 结 论

砧木嫁接对‘赤霞珠’果实发育产生了影响，其中砧木‘5BB’、‘SO4’嫁接‘赤霞珠’，增大‘赤霞珠’葡萄果粒，‘SO4’降低了‘赤霞珠’果穗紧实度，增加了果穗松散度，‘5BB’促进了‘赤霞珠’树体对N素的吸收，N作为大量元素是化肥的主要成分之一，‘5BB’砧木的利用对减少化肥施用有一定的实践意义。

‘赤霞珠’葡萄果实隐色花色素还原酶活性随着果实的发育进程而逐渐降低，‘101-14MG’和‘SO4’嫁接‘赤霞珠’葡萄果实隐色花色素还原酶活性略高于‘赤霞珠’自根苗；果皮中隐色花色素还原酶相对表达量远高于果肉；砧木嫁接后果实隐色花色素还原酶基因相对表达量随着发育时期和组织部位的变化趋势与自根苗总体相似，各砧木品种对‘赤霞珠’果实隐色花色素还原酶相对表达量有不同的影响，其中‘101-14MG’增加了果实隐色花色素还原酶基因相对表达量，其次是‘SO4’，‘5BB’对‘赤霞珠’果实果实隐色花色素还原酶基因相对表达量影响不大。

砧木的研究和利用越来越受到研究者的重视，近年来砧木品种选育工作取得了一定的进展，砧木嫁接对果实品质的影响成为砧木新品种评价的重要指标。