沙门氏菌胞外囊泡对肉仔鸡免疫保护效果的研究

梁 柳，胡如久，林 华，苏 源，高玉鹏，杨明明

(西北农林科技大学 动物科技学院, 陕西杨凌 712100)

沙门菌是肉鸡生产中常见的病原菌，会引起急性或慢性常见多发疾病，且是贯穿整个养禽周期的恶性循环式疾病，对人类和动物健康均具有极大危害[1]。沙门菌感染会引起各种疾病如鸡白痢、鸡伤寒和副伤寒，造成机体病变甚至死亡，对家禽养殖业造成极大的经济损失。预防和控制沙门菌感染的措施主要有药物防治和疫苗免疫。常用的疫苗有3大类：灭活疫苗、弱毒活疫苗和亚单位疫苗[2]。尽管这些措施在防控疾病方面有所成效，但仍存在一些缺陷。如：长时间用药控制沙门菌感染效果可能要好些，但是大剂量和频繁用药，成本很高，耐药性和药物残留也是大问题[3]；传统的疫苗存在免疫力低，免疫周期短，安全稳定性不好，生产程序复杂等[4]问题。因此，寻求一种更安全可靠，具有高免疫原性和免疫能力的方法来预防沙门氏菌感染势在必行。

细菌胞外囊泡(Outer membrane vesicles, OMVs)是革兰氏阴性细菌外膜在生长过程中自发释放的一种由脂质双层膜包围的球形囊泡[5]。OMVs的直径一般为50～200 nm[6]，主要含有蛋白质、核酸、磷脂、酶及脂多糖等生物活性分子。OMVs具有多种生物功能如：作为药物载体在机体内发挥作用和对细菌生理与病理的功能等[7]。OMVs中的脂多糖和外膜蛋白可以作为免疫评估分子的辅助剂刺激抗原呈递细胞，增强免疫反应[8]。OMVs也会产生多种毒性因子，如碱性磷酸酶、溶血性磷脂酶C和胆囊纤维调控因子抑制因子，从而影响宿主细胞生物学功能[9]。此外，OMVs还可诱导免疫调节功能，表面可以展示抗原，从而在宿主中引起强烈的炎症和免疫反应。从脑膜炎菌(N.meningitidis)中分离的OMVs可作为疫苗抵抗其引起的脑膜炎症[6]。Alaniz等[7]研究表明鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium,ST)OMVs(ST-OMVs)可以刺激促炎因子的产生，如肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha, TNF-a)和白介素-2(Interleukin-2, IL-2)。Muralinath等[10]研究表明ST获得的OMVs可诱发保护性免疫反应，并被用作载体从其他病原体中传递抗原。这些研究提示，一些革兰氏阴性细菌的OMVs具有开发成疫苗的潜力，并且OMVs疫苗是以纳米微囊泡的形式被宿主细胞识别，具有高效、毒性小等优点[11]。本试验旨在从ST培养液中分离并纯化ST-OMVs，探究其对肉仔鸡的毒性及免疫保护效果，为肉仔鸡的疫病防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株及其培养

鼠伤寒沙门氏菌(编号：CVCC2226)购自中国兽医药品监察所，将新鲜LB液体培养基于200 r/min 37 ℃的水平摇床上振荡培养。

1.2 主要试剂

酵母粉，蛋白胨，琼脂粉，氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，OptiPrepTM Density Gradient Medium溶液，BCA试剂盒购自南京建成生物技术有限公司。

1.3 ST-OMVs的分离、纯化与鉴定

将保存的ST菌种复苏，在新鲜LB液体培养基中于200 r/min 37 ℃的水平摇床上扩大培养；然后将培养物于4 ℃ 12 000×g进行高速冷冻离心15 min；取上清用直径为0.45 μm的滤膜过滤；过滤后的滤液经过100 ku滤膜进行超滤得到超滤浓缩液；浓缩液于4 ℃ 150 000×g进行超速离心2 h，去上清得到沉淀，用0.1 mol/L的PBS溶液重悬沉淀物。随后对重悬液采用从10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%到50%不同体积分数的OptiPrepTM Density Gradient Medium溶液进行梯度密度离心[12]，取20%～40%体积分数间的组分后超速离心2 h，富集得到的沉淀即为纯化ST-OMVs[12]，置于-80 ℃保存。

利用扫描电镜[13]来观察OMVs的外部形态特征，利用Nanosight NS300纳米颗粒跟踪分析仪[14]来测定OMVs的粒径与浓度，利用 BCA法[14]测定ST-OMVs的蛋白浓度。

1.4 试验动物及饲养管理

将350只1日龄健康爱拔益加(AA)雏鸡，在清洁环境中饲养至7日龄。选择经沙门氏菌感染为阴性、健康及体质量一致的320只肉仔鸡随机等分为5组，每组8个重复，每重复8只，试验设计分别为对照组(PBS组)、后期攻毒试验用的ST感染组(ST组)和3个不同剂量OMVs的ST-OMVs组，OMVs注射剂量分别为5、10和20 μg/(d·只)(OMV5、OMV10和OMV20)。饲养第1周采用24 h光照，室温保持在35 ℃，从8日龄开始每天降低1 ℃直到25 ℃。8日龄起采用23L：1D光照制度，每日19:00-20:00停止光照1 h。试验鸡饲喂商品饲料，0～21日龄饲喂前期料，22～36日龄饲喂中期料，营养成分满足或超过NRC(1994)的标准，每日于8:00、14:00和20:00 共投料3次，自由饮水。

1.5 ST-OMVs免疫程序

3个OMVs免疫组试验鸡从8日龄开始每隔1周对试验鸡腹腔注射200 μL含有OMVs的PBS，OMVs剂量分别为5、10和20 μg/(d·只)，每次连续3 d，共注射3次。即在8、9、10日龄进行第1次注射；在15、16、17日龄进行第2次注射；在22、23、24日龄进行第3次注射。PBS组和ST组按相同方法注射等量PBS溶液。每次注射前试验鸡禁水禁食2 h，注射后1 h恢复食水。

1.6 ST对试鸡的攻毒

30日龄时，对ST组和3个OMVs免疫组肉仔鸡腹腔注射1×109CFU的ST[15]，PBS组腹腔注射等量PBS溶液作为对照，继续观察饲养5 d。

1.7 样品采集与预处理

ST-OMVs第3次免疫后1周，即试验第29天，随机选定各重复的2只试验鸡翅静脉采血2 mL，以重复作为1个分析血样，屠宰，采集右侧胸腺、脾脏和法氏囊称量；血液37 ℃静置1 h后，4 ℃放置过夜，低温冷冻离心机1 500×g离心15 min，吸取上层血清，-20 ℃保存，用于血清免疫相关生理指标的测定。

试验鸡攻毒后的第5天，即试验第35天，随机选定各重复的2只试鸡翅静脉采血。血液置于抗凝管中，1 500×g，4 ℃离心15 min，吸取上清，-20 ℃保存，用于测定血清炎性细胞因子。

1.8 检测指标与方法

1.8.1 OMVs免疫期间的生产性能 试验开始时(第8天)记录初始体质量，分别在试验第15、22、29天(即一免、二免和三免1周后)8:00空腹称质量、结料，计算日均采食量(DFI)、平均日增量(BWG)和饲料效率(FCR)。

第8～29天，每天观察记录各重复死亡数，按周计算各组死亡率。

1.8.2 免疫器官指数测定 第29天采样时，胸腺、脾脏和法氏囊去尽脂肪和结缔组织，用滤纸吸干残血后，用分析天平称其湿量，计算胸腺、脾脏和法氏囊指数，即每100 g体质量中脾脏所占的质量。公式如下：

免疫器官指数(g/100 g)=免疫器官质量/试鸡体质量×100

1.8.3 血清免疫相关生理指标测定 测定第3次免疫1周后即试验第29天采集血清中免疫相关生理指标，本试验样品检测工作由北京华英生物技术研究所完成。溶菌酶活力(Lysozyme, LZM)：采用血清溶菌酶活性测定试剂盒测定；补体活力：采用免疫透射比浊法试剂盒测定血清补体C3质量浓度；白蛋白质量浓度(Albumin, ALB)：采用试剂盒溴甲酚绿比色法测定；超氧化物歧化酶活性(Superoxide dismutase,SOD)：采用超氧化物歧化酶测定试剂盒进行测定。

1.8.4 OMVs的免疫保护效果 攻毒后体质量变化。试验第30天，ST攻毒后，每日8:00按重复空腹对活鸡称量。

攻毒后存活率。ST攻毒5 d后，记录各重复死亡鸡数，计算各组存活率。

炎性细胞因子测定。采用放射免疫法测定试验第35天采集的血清，每重复2只鸡，以重复作为1个分析血样，测定其中的IL-1β(Interleukin-1β, IL-1β)、IL-6(Interleukin-6, IL-6)、TNF-α促炎性细胞因子的分泌量，本试验样品检测工作由北京华英生物技术研究所完成。

1.9 数据分析

采用SPSS 21.0统计软件One-Way ANOVA模块进行方差分析，用Duncan’s法进行多重比较，数据均用“平均值±标准差”表示，以P<0.05 作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

2.1 ST-OMVs生物特性分析

采用差速离心法从ST培养液上清中富集、密度梯度离心法纯化后得到较多量的纯化ST-OMVs沉淀。对纯化ST-OMVs进行扫描电镜检测，结果(图1)显示，无杂质、视野清晰，ST-OMVs大小不一，外形呈现圆形或椭圆形，直径100 nm左右，在50～200 nm范围之内，符合细菌OMVs颗粒粒径的要求。随后采用Nanosight检测纯化ST-OMVs的粒径分布(图2)，结果显示MODE曲线线条平缓流畅，说明含有的杂质较少，纯度较好；粒径峰值为76 nm，还有少数在100～200 nm间，与细菌OMVs的理论颗粒粒径大小值基本吻合，偏离范围的小部分可能与颗粒间粘着有关。最后，采用BCA法对纯化ST-OMVs进行蛋白定量，结果显示1×1010particles/mL的ST-OMVs的蛋白质量浓度为7.3 μg/mL。

图1 扫描电镜观察ST-OMVs形态Fig.1 Observation of ST-OMVs morphoiogical using SEM

图2 NAnosight检测ST-OMVs粒径分布Fig.2 NAnosight analysis of ST-OMVs

2.2 ST-OMVs对肉仔鸡生产性能及免疫功能的影响

由表1可知，与对照组相比，OMV5和OMV10组肉仔鸡在8～28日龄各阶段及整个免疫期的DFI、BWG和FCR均无显著差异(P>0.05)，而OMV20组试验鸡的DFI和BWG显著降低(P<0.05)，FCR显著增加(P<0.05)。OMV20组试验鸡在7～14 d和15～21 d有少量死亡，但与PBS组无显著差异(P>0.05)；OMV5和OMV10组均无试验鸡死亡。说明，5和10 μg/(d·只)的OMVs免疫剂量对免疫期间肉仔鸡生产性能没有显著影响，而20 μg/(d·只)的OMVs免疫剂量可显著降低免疫期间肉仔鸡生产性能。

由表2可知，虽然3个OMVs剂量免疫组试验鸡的免疫器官指数有高于PBS组趋势，但无统计学上的差异(P>0.05)。表3结果显示，OMVs免疫可显著提高免疫期间肉仔鸡血清中溶菌酶活力、白蛋白质量浓度、C3质量浓度及SOD活力(P<0.05)，并且OMV10组鸡血清的白蛋白质量浓度、C3质量浓度及SOD活力最高。说明OMVs免疫在一定程度上能够促进免疫器官生长发育，显著改善机体免疫功能。

表1 ST-OMVs对肉仔鸡生产性能及死亡率的影响Table 1 Effects of ST-OMVs on performance and mortality in broilers

注：同列数据后相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Note:In the same colum, values with the same letter or without letter superscripts mean no significant difference(P>0.05), the different lowercase letter superscripts mean significant difference(P<0.05).The same below.

表2 ST-OMVs对肉仔鸡免疫器官指数的影响Table 2 Effects of ST-OMVs levels on organ index in broilers

表3 ST-OMVs对肉仔鸡血清免疫相关生理指标的影响Table 3 Effects of ST-OMVs on serum immunity-related indices in broilers

2.3 ST-OMVs对肉仔鸡的免疫保护效果

由图3可知，除OMV20组试验鸡外，各组试验鸡攻毒前的初始体质量均无显著差异(P>0.05)。但随着攻毒后时间的延长，ST组试验鸡体质量出现显著下降(P<0.05)，而OMVs免疫组试验鸡体质量均显著增加(P<0.05)。与PBS组相比，OMV5和OMV10组的试验鸡体质量无显著变化(P>0.05)。表明，ST-OMVs免疫能够消除ST感染引起的鸡体质量下降。

由图4可知，与PBS组相比，ST组试验鸡的存活率显著降低(P<0.01)；OMV5组试验鸡的存活率显著低于PBS组(P<0.01)，但又显著高于ST组；OMV10和OM20组的试验鸡存活率与PBS组没有显著差异，且两者之间也没有显著差异(P>0.01)。表明，ST-OMVs免疫能够显著增强ST感染试验鸡的存活率，且OMV10和OMV20免疫组效果相对较好。综合免疫期间的生产性能和ST攻毒后的体质量和存活率指标，认为OMV10为OMVs的最佳免疫剂量组。随后比较分析OMV10组、ST组和PBS组试验鸡在攻毒5 d后血清中的促炎性细胞因子水平，由表4可知，OMV10组的IL-1β和TNFα分泌量显著低于ST组(P<0.05)，而OMV10组的IL-6分泌量虽然没有显著低于ST组，但有较大降低(0.05

图3 攻毒后肉仔鸡体质量变化Fig.3 Body mass change of broilers changed by ST

数据表示为“平均值±标准误”(n=8)；与对照组相比，**P<0.01, ***P<0.001

Data is expressed as “mean value±SEM”(n=8)；compared with control group,**P<0.01, ***P<0.001

图4 攻毒后肉仔鸡存活率Fig.4 Survival rate of broilers changed by ST

3 讨 论

OMVs是革兰氏阴性细菌自然释放的一种具有球形双层膜结构的分泌物，其粒径平均为50～200 nm。本试验采用扫描电镜和Nanosight纳米检测技术从形态学和颗粒大小对ST-OMVs进行系统分析，更好地验证了提取的OMVs的质量和纯度。试验结果表明，大多数的ST-OMVs直径在50～100 nm之间，呈圆形、椭圆形，大小各异，有的还聚集成团，符合文献报道[6]中关于OMVs的形态学特征。同时，也有一些超过范围的颗粒粒径，这可能是由于超速离心后囊泡融合在一起未吹散开的结果。

本试验研究了OMVs对肉仔鸡生长性能、死亡率和各免疫器官指数的影响，结果表明，OMVs免疫剂量在5和10 μg/(d·只)时对肉仔鸡生产性能没有显著的负面影响。当OMVs免疫剂量达到20 μg/(d·只)时，肉仔鸡生产性能出现显著下降，并伴随少量试鸡死亡。可见，就肉仔鸡生产性能而言，OMVs的免疫接种有一定的剂量范围，在此范围内的免疫对生产没有负面影响。本试验研究结果与Kim[15]利用大肠杆菌OMVs对小鼠的存活率的研究结果一致。可见，ST-OMVs对于肉仔鸡机体存在一定的安全性。此外，本研究发现，OMVs免疫可显著提高免疫期间血清中的溶菌酶活力、白蛋白和C3质量浓度及SOD活力。LZM是动物体液和组织中普遍存在的一种水解酶，是具有溶解细菌作用的非特异性免疫因子，在动物机体的免疫防御中发挥重要作用[16]。ALB几乎均由肝脏实质细胞合成，是血清中的主要蛋白质成分，能够说明机体的营养状态[17]。补体系统是动物预防细菌入侵的第2道免疫防线，特别是对革兰氏阴性细菌。作为血清中质量浓度最高的补体C3在机体的免疫应答中发挥极重要的作用[18]。SOD是一种普遍存在于生物界的活性物质，对生物体新陈代谢过程中产生的有害物质起清除作用[19]。试验表明高剂量[20 μg/(d·只)]的OMVs对肉仔鸡有一定负效应或毒副作用，影响其生长；低剂量[5 μg/(d·只)和10 μg/(d·只)]的OMVs的应用对肉仔鸡安全可行，具有免疫作用。

本试验记录了试验鸡在30日龄攻毒后5 d内的体质量变化和存活率，结果显示，ST-OMVs免疫能够消除ST感染引起的试鸡体质量下降，显著提高ST攻毒后试验鸡存活率。说明ST-OMVs免疫后可显著提高试验鸡抵抗ST感染的能力；攻毒后体质量和存活率的变化说明OMVs对于肉仔鸡具有免疫保护作用，与Liu等[20]对OMVs的免疫保护效果研究一致。本试验测定了30日龄鸡攻毒后的第5天血液炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。IL-1β、IL-6和TNF-α是由多种细胞分泌的促炎性因子，具有不同生物学功能，会介入炎性反应等病理与生理反应。Sinha等[21]研究表明，经霍乱弧菌(Vibriocholerae)OMVs作用能诱导骨髓源树突细胞分泌IL-1β、IL-6。Lee等[22]研究表明经肺炎双球菌(K.pneumoniae)OMVs诱导巨噬细胞分泌IL-6和TNF-α。乔智慧等[23]在对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中的研究同样表明当机体发生损伤时，IL-1β质量浓度会升高。本试验中，在30日龄进行攻毒后，未曾免疫过的ST组的肉鸡血清中的IL-1β质量浓度明显高于PBS组。Kim[15]研究表明受到大肠杆菌攻击后，OMV免疫的小鼠的血清和腹腔液中没有检测到IL-6和TNF-α水平的上升，而在未免疫小鼠中观察到这些细胞因子显著增加。然而，即使在OMV免疫小鼠中，腹膜液中的IL-6和TNF-α水平也增加，表明免疫组受细菌攻击仍会导致局部炎症。在本试验中，ST组与其他2组相比IL-6的质量浓度并没有显著差异，但是3组结果中，ST组的IL-6质量浓度高于PBS组，ST组TNF-α的分泌量显著高于其他2组，炎性因子的分泌趋势与Kim[15]研究结果一致。本试验中炎性因子的分泌量，与PBS组相比，OMV10组的分泌量还是有所上升，表明即使免疫组攻毒后还是会产生炎症，与前人[15]研究一致。

4 结 论

OMVs作为细菌向外空间分泌的一种物质体，作为免疫物质，在一定程度上能够促进肉仔鸡免疫器官生长发育，且免疫剂量为10 μg/(d·只)时对其生产性能没有显著的负面影响；当OMVs免疫剂量达到20 μg/(d·只)时则会明显导致肉仔鸡生产性能下降，并伴随少量试鸡死亡；OMVs免疫可显著提高免疫期间肉仔鸡血清中的溶菌酶活力、白蛋白质量浓度和C3质量浓度及SOD活力；ST-OMVs免疫能够消除ST感染引起的肉仔鸡体质量下降，显著提高ST攻毒后肉仔鸡存活率，ST-OMVs免疫后可显著提高肉仔鸡抵抗ST感染的能力，本试验中ST-OMVs最佳免疫剂量为10 μg/(d·只)。