小桐子CDPK及相关激酶基因家族的全基因组鉴定及表达分析

2019-01-24王海波郭俊云代冬琴唐利洲

西北农业学报 2019年1期

王海波,郭俊云,辛胡,刘潮,高永,代冬琴,唐利洲

(1.曲靖师范学院云南高原生物资源保护与利用研究中心，云南省高校云贵高原动植物遗传多样性及生态适应性进化重点实验室，生物资源与食品工程学院，云南曲靖 655011；2.西南林业大学林学院，昆明 650224)

在植物的整个生命周期中，受到外界多种生物与非生物环境因素的影响，在长期的进化中，植物形成了一套复杂的网络信号系统，经过胞外信号感知、膜上信号转换、胞内信号转导，及基因表达与蛋白活性可逆调控，以适应多变的外界环境[1]。Ca2+作为第二信使，在植物信号转导途径中发挥重要作用，在植物体中多种信号途径都会促发胞内Ca2+浓度的变化，进而通过钙信号感应器(CDPK-SnRK超家族)将信号传递至下游级联系统，包括：钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase，CDPK/CPK)、钙依赖蛋白激酶相关激酶(CDPK-related protein kinase，CRK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase kinase，PPCK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶相关激酶(PEP carboxylase kinase-related kinase，PEPRK)及钙与钙调素依赖蛋白激酶(Calcium and calmodulin-dependent protein kinase，CCaMK)等[2-4]。CDPK是植物与部分原生生物(Protozoa)特有的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，作为典型的Ca2+传感器，可不需要钙调素(Calmodulin，CaM)而被Ca2+直接激活[5]。典型的植物CDPK蛋白属于单体蛋白，仅由1条多肽链组成，从N端到C端包含4个结构域(功能区)，即N端可变区[包含豆蔻酰化(Myristoylation)与棕榈酰化(Palmitoylation)位点]、具有催化活性的Ser/Thr蛋白激酶区、活性控制的自抑制连接区以及包含2～4个EF-hand基序负责结合Ca2+的CaM调控区[6-7]。催化区由约300个氨基酸残基组成，具有典型的Ser/Thr蛋白激酶结构域，且不同物种中同源性较高。自抑制连接区由20～30个氨基酸残基组成，在没有Ca2+存在时，负责结合催化区的激酶结构域从而抑制其活性。调控区通过2～4个结合Ca2+的EF hands基序控制自抑制区的抑制活性[8]。CDPK调控区通过结合Ca2+解除自抑区对激酶区的抑制作用从而激活CDPK的活性，特别的独特结构使其同时具有Ca2+感应器与效应器的功能，在Ca2+信号转导过程中发挥核心作用。另外，CRK未鉴定到自抑区以及调控区的EF-hand基序，而CCaMK的自抑区与钙及钙调素结合结构域重叠，且调控区仅包含3个EF-hand基序，PPCK与PEPRK都包含激酶结构域，而PEPRK在N端与C端还包含可变区，但两者都没有结合Ca2+的EF-hand基序[7-9]。

研究表明，CDPK在植物的大部分器官中都有分布，且参与植物生长发育的大部分过程，如细胞骨架建成、气孔运动、小分子跨膜转运、碳氮代谢以及生物与非生物胁迫响应等。目前，已经对许多植物从全基因组水平进行CDPK及相关基因家族鉴定，CDPK基因家族包括拟南芥34个[8]、水稻31个[9]、玉米40个[10]、杨树30个[11]，CRK基因家族包括拟南芥8个[12]、水稻5个[9]、杨树9个[11]、番茄6个[13]；另外，在拟南芥中分别鉴定到PPCK、PEPRK、CCaMK基因2、2、0个[8]，对应水稻中包括0、2、1个[9]。小桐子(JatrophacurcasL.)属大戟科(Euphorbiaceae)麻疯树属(Jatropha)落叶灌木或小乔木，作为世界公认的具有巨大开发潜力的能源树种，其种子含油量高、品质好，是加工生物柴油的优质原料，具有广阔的开发利用前景。日本Kazusa DNA研究所在2011年公布小桐子基因组测序数据[14]，为从基因组水平上分析小桐子CDPK及相关激酶基因家族提供条件。本研究对小桐子CDPK及相关激酶基因家族从全基因组水平进行鉴定，并对其序列特征、进化关系及表达特性进行分析，为进一步研究CDPK及相关激酶家族基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 小桐子CDPK及相关激酶基因家族的鉴定

根据Cheng等[12]鉴定的模式植物拟南芥的CDPK及相关激酶基因家族登录号，从拟南芥TAIR数据库(https://www.arabidopsis.org/)下载拟南芥34个CDPK基因、8个CRK基因、2个PPCK基因、2个PEPRK基因以及水稻的1个CCaMK基因[9]蛋白质序列，通过ClustalX进行多重序列比对，利用Hmmer 3.0软件的Hmmbuild程序将比对文件生成CDPK结构域的隐马可夫HMM模型，同时，从GenBank下载小桐子最新注释蛋白质数据库。基于以上模型，利用Hmmer 3.0软件的Hmmsearch程序对小桐子蛋白质数据库进行检索(参数设置：阈值E<1e-10，序列相似性>50%)，得到候选的小桐子CDPK及相关激酶蛋白质序列，利用Excel脚本去除重复序列。将非冗余的候选序列利用Pfam与CDD在线工具进行CDPK激酶结构域分析，得到最终的小桐子CDPK及相关激酶家族蛋白质序列。

1.2 小桐子CDPK及相关激酶家族基因及蛋白质的特征分析

根据鉴定的小桐子CDPK及相关激酶蛋白质登录号，从GenBank下载其对应的基因序列、mRNA序列以及CDS(Coding sequence，CDS)序列。利用ProtParam工具(http://web.expasy.org/protparam/)对CDPK及相关激酶蛋白质进行氨基酸数目、理论分子质量(Mw)、等电点(pI)等基本参数的分析。亚细胞定位采用CELLO服务器V2.5(http://cello.life.nctu.edu.tw/)进行鉴定。利用PROSITE(http://prosite.expasy.org/)在线分析工具对CDPK及相关激酶蛋白质序列进行motif分析。利用ClustalX(Version 2.0)进行序列相似性比对，然后用MEGA 6.0软件通过邻接法(NJ)构建系统进化树，并采用自展法(Bootstrap)进行检验。利用GenDOC软件对ClustalX比对结果进行CDPK及相关激酶蛋白的保守结构域分析。通过CDS序列与基因序列比对以确定基因内含子与外显子的结构，并利用GSDS(Gene Structure Display Server，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)绘制基因结构图。另外，染色体定位以Wu等[15]构建的小桐子遗传连锁图谱进行锚定，并通过MapChart(Version 2.1)绘制基因定位图。

1.3 小桐子CDPK及相关激酶家族基因的表达分析

从GenBank的SRA数据库下载小桐子不同器官的Illumina高通量测序数据(叶片SRR1639660、根SRR1639659、种子SRR1639661)。通过Bowtie2与Samtools工具将鉴定到的小桐子CDPK及相关激酶家族基因与测序数据进行比对，得到各CDPK及相关激酶基因的表达reads数据，之后通过Cufflinks程序计算每个基因的表达量FPKM(Fragments Per Kilobase per Million)值，进行以2为底的对数转化，并设置以基因与器官同时进行聚类，聚类方法选择层次聚类法(Hierarchical Clustering)。另外，将鉴定的小桐子CDPK及相关激酶家族基因序列对低温转录组数据[16]进行比对，通过编号得到各基因在对照与12 ℃低温处理12、24及48 h的低温数字基因表达谱(Digital Gene Expression，DGE)[17]中的原始表达标签CleanTaq数据，进一步通过TPM(Transcript per Million Clean Tags)获得标准化的基因表达量[18-19]，经过log2(处理TPM/对照TPM)转化，得到小桐子CDPK及相关激酶家族基因在低温处理下的差异表达数据。利用R软件(Version 3.4.1)的gplots与pheatmap函数进行聚类分析及热图(heatmap)的绘制。

2 结果与分析

2.1 小桐子CDPK及相关激酶基因家族的鉴定与序列特征

在小桐子全基因组共鉴定到17个CDPK基因，分别命名为JcCDPK1-JcCDPK17，5个CRK基因(JcCRK1-JcCRK5)、2个PPCK基因(JcPPCK1、JcPPCK2)、4个PEPRK基因(JcPEPRK1.1、JcPEPRK1.2、JcPEPRK2.1、JcPEPRK2.2)及1个CCaMK基因(JcCCaMK)(表1)。理化参数分析结果表明，小桐子JcPPCK1与JcPPCK2基因(1 389 bp、1 574 bp)与蛋白(271 aa、276 aa)序列较短，CDPK及相关激酶基因长度分布在2 904(JcCDPK15)～9 631(JcCDPK14)bp，蛋白序列长度分布在466(JcPEPRK2.1)～630(JcCRK5)aa。其中，等电点有明显的家族特异性，CDPK基因家族的Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ亚族、PPCK基因家族Ⅰ亚族、CCaMK基因家族成员的等电点都偏酸性与中性，分布在5.31(JcCDPK10)～7.21(JcCDPK11)，而CDPK基因家族的Ⅳ亚族、CRK基因家族及PPCK基因家族Ⅱ亚族都偏碱性，分布在8.43(JcPEPRK2.2)～9.02(JcCDPK17)。CELLO亚细胞定位显示，小桐子CDPK基因家族主要定位细胞质(15个)、其次为细胞核(2个，JcCDPK2与JcCDPK17)，CRK基因家族定位细胞核与叶绿体，PPCK基因家族都定位细胞质，PEPRK基因家族定位细胞核与细胞膜，而CCaMK定位细胞核。

2.2 小桐子CDPK及相关激酶基因家族的系统进化与基因结构

根据Harbak等[8]关于拟南芥CDPK及相关激酶基因家族的分类标准，通过MEGA构建小桐子与拟南芥CDPK及相关激酶基因家族进化树(图1、图2)，可见小桐子与拟南芥聚类结果(图1)与小桐子单独聚类结果(图2)完全吻合，小桐子CDPK基因家族也聚类为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个亚族，基因数量分别为6、5、6、1，较拟南芥对应亚族基因10、13、8、3数量少，其中第Ⅳ亚族只有JcCDPK17基因。另外，小桐子CRK、PPCK及PEPRK基因家族分别鉴定到5、2、4个基因，对应拟南芥中包含8、2、2个基因，CCaMK基因家族在拟南芥中未发现，而在小桐子中鉴定到1个对应JcCCaMK基因，与Asano等[9]在水稻中鉴定到OsCCaMK1(GenBank登录号：AC097175)的报道一致。

结合小桐子29个CDPK及相关激酶家族的聚类结果，基因结构分析显示，小桐子CDPK基因家族除Ⅳ亚族JcCDPK17包含12个外显子外，其他3个亚族都包含6～9个外显子(图2、表1)，且首尾外显子都与5-UTR与3-UTR区域重合，中间为分散且长度较短的外显子。其中，Ⅰ亚族除JcCDPK4(9个外显子)，都包含7个外显子，且都鉴定到5-UTR与3-UTR区域；Ⅱ亚族除JcCDPK15(6个外显子)，都包含8～9个外显子，而JcCDPK2与JcCDPK15分别缺失5-UTR与3-UTR区域；Ⅲ亚族包含7～9个外显子，而JcCDPK16缺失5-UTR区域。同时，小桐子CRK基因家族成员都包含11个外显子，且外显子分布规律完全一致，PPCK基因家族成员都包含2个外显子，PEPRK基因家族包含3～5个外显子，且Ⅰ(JcPEPRK1.1、JcPEPRK1.2)与Ⅱ(JcPEPRK2.1、JcPEPRK2.2)亚族成员基因结构一致，而CCaMK基因家族的唯一成员JcCCaMK包含7个外显子。

黑色圆点表示Bootstrap检验值的大小 Bootstrap values were represented by black dots

图2 小桐子CDPK及相关激酶基因家族的基因结构Fig.2 Gene structure of J.curcas CDPK and its related kinase genes family

2.3 小桐子CDPK及相关激酶氨基酸序列分析

为了分析小桐子CDPK及相关激酶的保守序列，通过多序列比对鉴定到小桐子CDPK家族成员的N-端可变区、激酶结构区、自抑区及EF-hand调控区4个保守结构域以及其他激酶成员的激酶结构域。其中，N-端可变区氨基酸序列整体变化较大，而前8个氨基酸残基相对保守，PROSITE分析显示该区域是与CDPK及相关激酶修饰调控相关的序列，通过ExPASY的N-Myristoylation与CSS-plam 4.0工具分析29个小桐子CDPK及相关激酶表明，有21个鉴定到与N-豆蔻酰化(N-Myristoylation)修饰相关的核心氨基酸残基Cys，其中11个可能会发生N-豆蔻酰化修饰，另外，有24个可能会发生N-十六烷酰化(N-Palmitoylation)修饰(表1)。

CDPK及相关激酶都包含约300aa的核心激酶结构域，多序列比对结果表明，小桐子CDPK的激酶结构域保守性较高，鉴定到与CDPK激酶催化相关的保守序列C-E/A-G-G-E-L-F-D-R-I、H-R-D-L-K-P-E-N-F-L-F/L、D/E-V/I-V-G-S-P/A-Y-Y、A-P-E-V-L、D-V-W-S、G-V-M/I-L-Y-I-L-L、G-V-P-P-F-W、P-W-P-x-V/I-S、A-K-D-L-V以及H-P-W[20](图3)，以及催化活性中心的核心氨基酸残基Asp(图3三角形所示)。

实线表示激酶结构域的保守基序，三角形表示激酶结构域的催化核心Asp残基 Solid line indicates conserved motifs in kinase domain ofJ.curcasCDPK,the triangle indicates the core catalytic Asp residue in the kinase domain

图3小桐子CDPK激酶结构域多序列比对
Fig.3MultiplealignmentforconservedkinasedomainofJ.curcasCDPK

CDPK激酶调控区的EF-hand基序通过结合Ca2+从而解除自抑区对激酶结构域的抑制作用，其中，Ca2+主要结合EF-hand基序的Asp(D)或Glu(E)，在小桐子CDPK激酶的调控区也鉴定到4个保守EF-hand基序(1st、2nd、3rd、4th EF-hand)，以及对应的4个保守的序列D-x-D(图4三角形所示)，另外发现每个EF-hand基序的保守D-x-D序列之后都包含富含Glu(E)的一段保守序列E-E-L-K(1st EF-hand)、E-E-I/L-A/T(2nd EF-hand)、D/E-E-L(3rd EF-hand)以及E-F-A/V-T/A-M-M(4th EF-hand)(图4)。

虚线表示自抑区，实线表示4个EF-hand保守基序；双实线表示EF-hand基序的核心序列；三角形表示EF-hand基序的保守D-x-D残基 Dotted and solid lines show conserved motifs of auto-inhibitory and EF-hands ofJ.curcasCDP,respectively,the double lines and the triangles represent the core sequences and the conserved D-x-D residues in the EF-hand,respectively

图4小桐子CDPK自抑区与EF-hand区多序列比对
Fig.4Multiplealignmentforconserveddomainsandmotifsinauto-inhibitoryandEF-handregionsofJ.curcasCDPK

2.4 小桐子CDPK及相关激酶基因家族染色体定位

依据Wu等[15]构建的小桐子高密度遗传连锁图谱，在染色体水平定位每个小桐子CDPK及相关激酶基因，结果表明，除11号染色体没有基因分布外，28个小桐子CDPK及相关激酶基因(JcCRK4基因没有染色体定位信息)不均匀地分布于其余10条染色体上，其中，6号染色体上的基因数量最多(6个)，且发现该基因家族的串联复制基因JcCDPK7/JcCDPK9，而1、2、3、4、7及10号染色体上的基因较少，各包含2个(图5)。

2.5 小桐子CDPK及相关激酶家族基因的表达分析

基于小桐子叶片、根及种子转录组测序数据，得到小桐子29个CDPK及相关激酶基因的表达数据(图6)。结果表明，29个CDPK及相关激酶基因，在叶片、根及种子中有24个基因都有表达，而3个基因都未鉴定到表达。其中，JcCDPK1、JcCDPK4、JcCDPK8、JcCDPK13及JcPEPRK1.2在3种器官中表达量都较高(log2FPKM>4.0)，但JcCDPK9、JcCDPK15及JcCDPK16在3个器官中都没有表达(log2FPKM<0)。其他基因存在器官表达特异性，在叶片、根及种子中表达量最高的基因分别为JcCDPK13、JcCDPK4及JcPEPRK2.2。另外，JcCDPK7在叶片与种子中有表达，而在根中不表达，JcCCaMK在根中有表达，而在叶片与种子中没有表达。

竖线表示基因串联复制 Vertical line indicates tandem duplication；刻度表示厘摩 Scale is in centiMorgans (cM)；LG表示染色体 Chromosome

图5小桐子CDPK及相关激酶家族基因的染色体定位
Fig.5ChromosomaldistributionofJ.curcasCDPKanditsrelatedgenefamily

通过DGE数据分析得到11个小桐子CDPK及相关激酶家族基因在低温处理条件下的表达数据(图7)。与对照相比，JcCDPK3在低温胁迫12、24及48 h时都上调表达显著，而JcPEPRK1.1与JcPEPRK2.2仅在低温胁迫24 h上调表达显著。另外，随着低温胁迫时间的延长，JcCDPK11、JcCRK3及JcCCaMK的表达量呈连续上升的趋势，在低温胁迫48 h时，表达量分别较对照提高4.23、7.41和2.25倍。聚类热图显示，其他基因也属于低温诱导表达基因，其中，JcCDPK1在低温胁迫24 h达到最大表达量，较对照提高1.56倍，而JcCDPK13、JcCDPK17、JcPPCK1及JcPPCK2都表现出2次上调表达峰值，分别在低温胁迫48 h、12 h、48 h及12 h达到最大表达量。

图6 小桐子CDPK及相关激酶家族基因的器官差异表达分析Fig.6 Differential expression of J.curcas CDPK and its related kinase gene family in different organs

3 讨论

有文献[21]报道，在藻类与陆生植物分化之前CDPK家族基因就已经分为4个亚族。双子叶植物拟南芥[8]、杨树[11]及小桐子，单子叶植物水稻[9]与玉米[10]的CDPK家族基因进化分析结果也聚类为4个亚族，暗示CDPK基因功能的分化也是在单、双子叶植物分化之前就已经完成。另外，CDPK属多基因家族，不同物种中数量差异较大，如单子叶植物水稻31个[9]、玉米40个[10]，双子叶植物拟南芥34个[8]、杨树30个[11]、草莓15个[22]、桃15个[23]。本研究鉴定的小桐子CDPK基因17个。从以上基因数量可以看出，CDPK家族基因在不同物种之间存在2倍关系。据报道[24]，在显花植物进化中，全基因复制事件是导致基因家族成员数目增加的重要途径。以上结果也表明，大部分单子叶植物与部分双子叶植物经历了一次全基因组复制事件，而双子叶植物只有少数发生以上事件，且是在单双子叶植物分化之后发生的，说明小桐子CDPK家族基因在单双子叶植物分化之前就已聚为4类不同功能的亚族，而分化之后，未发生全基因组复制事件。另外，在经历全基因组复制的物种中还发现大量基因片段复制现象(Tandem duplication)，如水稻的OsCPK25/26(相似性99.6%)、OsCPK3/16(91.9%)、OsCPK2/14(86.8%)、OsCPK24/28(86.5%)及OsCPK1/15(86.2%)[9]，杨树的PtCDPK2/3(相似性93.0%)、PtCDPK5/6(93.0%)、PtCDPK10/11(93.0%)、PtCDPK25/26(93.0%)、PtCCaMK1/2(93.0%)[11]等，而在双子叶植物小桐子中只鉴定到JcCDPK7/JcCDPK9一对基因复制，也证明CDPK基因数量较多的植物在进化中大部分发生了全基因组复制事件，导致大量相似性较高的CDPK基因出现，而未发生复制事件的植物如小桐子只有极少数的基因片段复制。另外，CRK、PEPRK基因家族在拟南芥[8]、水稻[9]与小桐子基因组中都有分布，而PPCK与CCaMK基因家族存在物种特异性，如PPCK基因家族在拟南芥与小桐子中都包含2个成员，而水稻中未鉴定到[9]，CCaMK基因家族在水稻与小桐子中都包含1个成员，而在拟南芥中未鉴定到[8]。

转录组表达数据显示，小桐子CDPK及相关激酶基因有3种器官表达模式，第1类有显著的器官表达特异性，如小桐子JcCDPK7在叶片与种子表达，而在根中没有表达，JcCaMK在根中有表达，而在叶片与种子没有表达，相同的研究结果在其他物种也有报道，如烟草NtCDPK1的转录本存在于茎、根及花中，而在叶片中未检测到[25]，小麦TaCPK13在叶片、幼穗及未成熟的种子中表达，而在根与茎中不表达[26]。第2类在不同的器官中没有显著表达差异，如小桐子JcCDPK1、JcCDPK4、JcCDPK13、JcCRK1及JcCRK5在考察的3种器官中表达量基本一致，类似研究如番茄LeCDPK1在叶片、茎、根及花中表达量基本相同，小麦TaCPK2在叶片、茎、根、幼穗及未成熟的种子中表达量没有差异[26]。另外，鉴定发现JcCDPK15与JcCDPK16在小桐子不同器官中都未表达。第3类为所有器官都有表达，但存在表达差异性，如蚕豆VfCPK1在各个器官都有表达，但在下表皮和叶片中的表达量显著高于茎与根[27]，而小桐子的JcPPCK1在叶片、根及种子中都有表达，但叶片的表达量高于种子，JcCDPK14与JcPEPRK1.1在根与种子中表达量较高，而在叶片中较低(图6)。以上3种表达模式暗示，部分小桐子CDPK及相关激酶基因属于看家基因，在所有器官中都发挥作用，且可能参与大部分代谢途径或信号转导过程；相反，部分基因在特异器官或全部器官中都未见表达，推测可能是表达基因的同源基因，也可能是通过生物或非生物因子诱导才能表达的基因。同时，多数CDPK及相关激酶基因与植物逆境信号转导相关。Sheen[28]发现拟南芥AtCDPK1与AtCDPK1a在干旱与盐胁迫下表达量显著上调。而本研究中JcCDPK3、JcCDPK11、JcCRK3及JcCCaMK在低温胁迫下表达量增加明显，属于小桐子抗冷性及低温信号转导相关的基因(图7)。