鸢尾联合固定化菌剂净化河道水体的微生态过程

刘宗楠，王 新，吴逸飞，姚晓红，孙 宏，沈 琦，李维琳，汤江武，*

(1.华中农业大学 生命科学与技术学院，湖北 武汉 430070； 2.浙江省农业科学院 植物保护与微生物研究所，浙江 杭州 310021)

随着城市化、工业化进程加快，以及现代农业的发展，我国水环境污染日益严重，水体生态系统遭到不同程度的破坏。氮、磷是引起水体污染和富营养化的主要物质，会导致水体水质和生态系统变化，并影响水体功能[1]。污染水体的修复和治理技术研究是当前的热点领域，其中，生物修复技术因具有环境友好、生态节能的优点，受到广泛重视。水生植物能通过自身同化降低水体中N、P浓度，促进水体营养的输出，有效调控水生态系统的物质循环和能量流动，因此，恢复水生植被是控制水体富营养化的一种重要的生态方法。在污染严重的水体中，常采用生态浮岛的方式构建水生植被来净化水体[2-5]。水环境中污染物的转化和去除，更多地依赖于微生物的作用。微生物用于污染水体的原位修复，在国内已经有不少成功的例子，如上海上澳塘、绥宁河、苏州河，广州朝阳涌，昆明西坝河，东莞珊洲河、万江，北京大观园中心湖，桂林桃花江等[6-8]。微生物固定化技术的发展，可显著提高功能微生物的沉降性能，提高水质净化效率， 在原位应用中可有效解决微生物的流失问题，还具有抗环境因子影响、使用成本低廉等诸多优点[9-11]。然而，在实际应用中，当前基于生态浮岛的植物修复技术存在可靠性不稳定、不同地域污染水体处理效果差异大、受季节影响大等问题，与其他生态修复技术，如微生物强化修复、碳纤维生态基等的耦合，是提升其作用效果的有效途径，也符合水环境治理技术综合性、系统性发展的趋势。近年来，植物-微生物联合处理污水的研究受到重视[12-13]，但总体来说，相关研究主要集中在植物-微生物联合处理污染水体的作用效果方面，对其在水体中的相互作用过程，以及对水体微生态环境变化的影响知之甚少，势必会影响植物、微生物这两种生物修复技术的有效结合和综合应用。本文以鸢尾为研究对象，通过其与固定化净水菌剂共同作用处理河道污水的实验研究，探索水体净化过程中水体功能微生物群落的变化，分析植物-微生物的相互作用和耦合效应，为污染水体生物修复技术的发展和综合应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验水样来源及实验方法

实验用水样采集自杭州市城郊河道(120°20′48″E，30°31′65″N)，水体氨氮含量约4.7 mg·L-1，化学需氧量(CODMn)约为17.0 mg·L-1。水样分装在特制的实验装置中，中间为布水槽，两侧为实验槽，包括布水槽在内，均等分为5个实验容积约80 L的单独水槽，每个实验水槽外侧靠近顶部设置出水口，和布水槽相连的内侧底部为进水口，布水槽之间的隔断低于实验槽外侧的出水口。实验所用植物材料为白花鸢尾(Iristectorumf.alba)，用实验河水经过一段时间的培养后，选取生长状况良好、长度差异在2 cm以内的植株备用。实验分为鸢尾(YW)、鸢尾+固定化净水菌(YWB)、固定化净水菌(CKB)、空白对照(CK)4个实验组，其中，YW和YWB组设置3个平行样，CKB和CK组设置2个平行样。含有植物的样品，每个植入3株，培养7 d后，用网袋装入20 g固定化净水菌，固定在鸢尾的根部，开始实验。每天用于流加的河道污水提前抽入大容量水桶中，调控水体氨氮在(4.2±0.5) mg·L-1，从实验装置的中间槽流加河道污水，控制进水量，使河道污水在实验装置中的停留时间约为10 h。实验环境温度为自然温度(14～18 ℃)，实验开始后在进水端采集原始水样，随后每天在各实验槽的出水段采集水样，测定水质参数，并隔天采集、保存分子样品(共采集6次)，用于微生物群落结构和多样性分析。

1.2 固定化净水菌的制备

实验所用菌株AOZ1(Enterobactersp.)和BSK9(Bacillussubtilis)分别具有氨氧化和COD降解功能，由浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所环境微生物研究室分离筛选并保藏，菌剂经LB液体培养基发酵后离心，获取菌泥，用于固定化净水菌剂的制备，方法如下：配制4%海藻酸钠水溶液100 g，混匀后水浴加热，维持在60 ℃，加入硅藻土50 g搅拌均匀，冷却至50 ℃以下加入菌剂，进一步混合倒入模具，自然冷却成型后浸入4% CaCl2水溶液中固化过夜，最后用去离子水洗净沥干备用[10]。采用该方法制备的固定化净水菌，载菌量约1.32×1011g-1，15 d平均释放量约为5.41×106g-1·d-1。

1.3 水样细菌总DNA的提取

采集50 mL水样，用0.22 μm微孔滤膜过滤收集菌体，滤膜用铝箔包裹，液氮速冻后存于-20 ℃冰箱备用。提取DNA时，将收集了大量菌体的滤膜剪成碎片，然后采用MOBIO PowerWater®DNA Isolation Kit，参照试剂盒附带的操作步骤，提取样品中的DNA。获得的DNA用Nanodrop 2000检测后，存于-20 ℃冰箱备用。

1.4 细菌16S rDNA、氨氧化和反硝化功能基因扩增和高通量测序

提取获得的水样总DNA送交杭州利贞生物医药科技有限公司，PCR扩增细菌16S rDNA、氨氧化和反硝化功能基因片段，PCR产物经定量和均一化后，制备MiSeq PE文库，采用Illumina PE250平台进行高通量测序。用于PCR的引物，含barcode序列。用于细菌16S rDNA基因扩增的引物为：515F，5′-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′；907R，5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′[14]。用于氨氧化功能基因扩增的引物为：amoB-1Fmod，5′-barcode-CTGGGGTTTCTACTGGTGGTC-3′；GenAOBR，5′-GCAGTGATCATCCAGTTGCG-3′[15]。用于反硝化功能基因nirS扩增的引物为：Cd3aF24，5′-barcode-GTSAACGTSAAGGARACSGG-3′；R3cd101，5′-GASTTCGGRTGSGTCTTGA-3′[16]。PCR为20 μL反应体系，采用TransStartFastpfuDNA Polymerase。16S rDNA基因反应条件为：95 ℃变性240 s；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27 个循环；最后72 ℃延伸10 min。氨氧化功能基因反应条件为：98 ℃变性2 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 45 s，27 个循环；最后72 ℃延伸10 min。反硝化功能基因反应条件为：95 ℃变性5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，27个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经定量和Miseq文库构建后，上机进行高通量测序。

1.5 测序数据分析

测序获得数据，参考文献[17-18]提及的方法进行处理，利用Uparse version 7.1(http://qiime.org/)软件平台进行操作分类单元(OTU)聚类，采用RDP classifier对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并在各个水平上统计每个样品的群落组成。在QIIME中调用blast方法与序列数据库Greengene(http：//greengenes.secondgenome.com)进行16S rDNA比对，在FGR(http://fungene.cme.msu.edu/)中进行功能基因比对，获得每个OUT代表序列的分类学信息。利用Mothur软件做稀释性曲线分析， 用香农指数(Shannon)计算细菌生态多样性指数，用Origin 9.5制作群落结构组分图，用R语言做主坐标分析。

1.6 分析方法

水样中氨氮含量参照HJ 536—2009进行测定，总有机碳(TOC)、总氮(TN)采用耶拿MULTIN/C 3100型测定仪测定，COD采用重铬酸钾比色法测定，温度与溶解氧(DO)采用梅特勒SG98型溶氧仪直接测定。各项水质指标的测定，均为3个平行样品。

1.7 数据分析

采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析，对有显著差异(P<0.05)的处理采用Tukey法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 对河道污水的净化效果

实验流加的河道污水氨氮含量为(4.2±0.5) mg·L-1，总氮浓度为(4.8±0.5) mg·L-1，COD为(20.0±0.5) mg·L-1。实验开始后，进行连续采样检测，环境温度在14～18 ℃。测定结果显示，平均溶氧YW组为8.0 mg·L-1，高于YWB组的7.7 mg·L-1，CKB组为9.4 mg·L-1，稍高于CK组的9.3 mg·L-1。

河道污水的动态流加使进水水质稳定在一定范围内，在实验装置中经过约10 h的停留后，出水水质发生变化。各个实验组出水中氨氮均呈下降趋势，在6 d之后基本稳定，表明整个装置运行处于稳定状态。CK组的氨氮变化趋势与其他实验组基本相同，也呈下降趋势，这与水体中本身存在的微生物的作用有关。YW、YWB、CKB组出水中的氨氮均显著(P<0.05)低于空白对照组，但YW和YWB组之间差异不显著。

出水的总氮在4.97～6.50 mg·L-1，这可能与进水总氮的波动有关，除第2、7、8天外，各实验组总氮含量没有显著差异。整个实验系统内总氮的去除效率较低，这可能与实验体系内溶氧较高有关。

各实验组出水中TOC均呈下降趋势，在3 d之后基本稳定，显示整个装置对TOC的去除有一定的作用，但各实验组之间的差异不显著。

各实验组出水的COD在7.75～19.0 mg·L-1波动，各实验组的变化趋势基本相同，组间没有显著差异，整体对COD的去除效率较低。

2.2 净水过程中水体细菌群落组成和多样性

采用高通量测序分析实验过程中水体细菌的群落组成和多样性。样品测序序列数多于65 718条，以随机抽到的序列数及其对应的OTU种类绘制稀释性曲线，结果表明，测序深度能够真实反映样品中优势细菌的数量关系。以97%相似性水平为标准划分OTU，在24个样本中共获得6 763个OUT，各样品的OTU数量在1 663～2 833，分别对应CK组第2次样品(CK2，下列标记方法同)和YWB3。通过样品测序序列计算各样品的香农指数，最高值为YW2的5.88，最低值为YW5的4.68，除了YW组外，其他各样品的多样性变化不大。

对全部样品获得的OUT进行注释，结果显示，样品细菌主要集中在变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻菌门(Cyanobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、软壁菌门(Tenericutes)、螺旋菌门(Spirochaetae)等10个菌门。各个样品中，变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门、蓝藻菌门的含量合计，除YW2(86.0%)、YW4(88.0%)和YWB2(84.6%)外，均超过91.7%，说明整个体系细菌种类在门的水平比较稳定。在属的水平上，相对丰度较高的OUT分属67个属(图2)，其中，拟杆菌属(Bacterioides)、丛毛单胞菌属(Comamonadaceae)、蓝细菌属(Cyanobacteria)、黄质菌属(Flavobacterium)、Malikia、Limnohabitans、Pseudarcicella、新鞘氨醇菌属(Novosphingobium)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、红杆菌属(Rhodobacteraceae)、Faecalibaculum等属在细菌群落组成中占有较高比例。因相对丰度较低，归入“其他”类别(others)的属，在不同样品中的总相对丰度在23.0%～32.3%，表明实验水样中具有较高的细菌多样性。

图1 动态实验中水体氨氮、总氮、TOC和COD的变化Fig.1 Variation of ammonia nitrogen， total nitrogen， total organic carbon and chemical oxygen demand

分析不同时间不同组样品群落组成的差异，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)之和为71.37%(图3)。各实验组在实验开始时水体的细菌群落结构具有较高相似性，这与实验起始阶段各实验组水体细菌群落尚未发生显著变化相一致。随后各个实验组的细菌群落开始发生变化，其中，YW组水体细菌群落在3～11 d聚在一起，显示鸢尾的生长可能对水体的细菌群落结构稳定有一定作用。YWB组和其他实验组一样，细菌群落结构在3～11 d呈现显著变化，表明固定化微生物的释放，对实验水体细菌群落结构产生较大的影响。除YW组外，其他组水样细菌群落结构从第9天开始趋同，而YW组在第11天也与其他各组水体的细菌群落结构相近，表明动态实验过程中，水体细菌群落有一个动态的变化过程，这个过程也可能是水体微生物功能发生变化的过程。

图2 水样中主要细菌在属水平上的相对丰度Fig.2 Relative abundance of dominant bacteria at genus level in water samples in different time

图3 水样中细菌群落结构的主坐标分析Fig.3 Principal coordinate analysis from bacterial 16S rDNA gene sequences

2.3 净水过程中水体功能微生物群落组成和多样性

以amoB基因为分子标记，分析实验过程中水体氨氧化细菌的群落组成和多样性。样品测序序列数多于53 925条，稀释性曲线表明，测序深度能够真实反映样品中优势菌的数量关系。以97%相似性水平为标准划分OTU，24个样本的OTU数量在138(YW3)～544(CK1)。通过样品测序序列计算各样品的香农指数，最高值为1.53(CK5)，最低值0.83(YW3)。除了YW6和CKB3外，其他各样品的多样性变化不大。对amoB基因测序获得的OUT进行注释，结果显示，24个样品中具有amoB基因的细菌98.3%以上主要集中在变形菌门和未分类的细菌中，其中，CK3、CK6、CKB2、YW3、YW4、YWB2、YWB3、YWB6以未分类细菌为主，相对丰度在98.3%～99.7%。在属的水平上，99.35%～99.96%的属存在于未能分类的细菌以及变形菌门各属中，仅有较低丰度的细菌存在于已知的氨氧化细菌种属，如Nitrosomonadaceae(unclassified)、Nitrosomonadales(unclassified)、Nitrosospira、Nitrosovibrio中。

以nirS基因为分子标记，分析实验过程中水体反硝化微生物的群落组成和多样性。样品测序序列数多于73 630条，稀释性曲线表明，测序深度能够真实反映样品中优势菌的数量关系。以97%相似性水平为标准划分OTU，24个样本的OTU数量在38(CK4)～115(YW2)。通过样品测序序列计算各样品的香农指数，最高值为2.85(CKB1)，最低值1.94(YWB4)，其他各样品的多样性变化不大。对nirS基因测序获得的OUT进行注释，结果显示，24个样品中具有nirS基因的细菌96.1%以上主要集中在变形菌门(相对丰度68.2%～90.3%)和未分类的细菌中。在属的水平上，相对丰度较高的OUT分属6个属(图4)，分别为Proteobacteria(unclassified)、Bacteria(unclassified)、动胶菌属(Zoogloea)、脱氯单胞菌(Dechloromonas)、红环菌科(Rhodocyclaceae_unclassified)、Betaproteobacteria(unclassified)。除未分类的属外，“其他”类别(others)也是反硝化细菌常见的种属。

通过主坐标分析法分析不同组样品反硝化功能微生物群落组成的差异，第一主成分和第二主成分之和为69.79%(图5)。结果显示，各实验组的反硝化微生物群落结构在不同分组之间不能有效分开，表明它们之间的差异总体不大。但与起始相比，各实验组反硝化微生物群落结构均发生了显著变化，这表明动态实验过程中，尽管受到不同处理因素的影响，水体反硝化微生物群落仍具有一定的稳定性。

3 讨论

本实验显示，鸢尾与固定化菌剂在动态模拟实验中对河道污水中的氨氮和TOC具有稳定的去除作用。在净水过程中，水体细菌群落发生动态变化并最终趋同。鸢尾与固定化菌剂对水体反硝化功能微生物群落存在一定的影响，且表现为一定的协同作用，但固定化净水菌的作用强于鸢尾。

水环境治理的科技发展逐渐从单向治理走向综合治理，作为常用的有效生物修复技术，植物和微生物修复技术在实践中已经得到了广泛的应用[3-4，12，19]，将两者结合在一起，优势互补，形成综合的水体修复技术，是未来的发展方向。通常认为，除了对无机污染物的直接吸收外，水生植物根系微环境形成的根际微生物群落，对水体污染物的去除也具有重要作用，这是植物和微生物联合应用于污染水体修复的基础[20]。已有不少研究关注植物-微生物结合用于水体修复的效果[12-13]，以及水生植物根际微生物的群落结构和多样性[21-22]，试图探索植物影响水体微生物，进而影响水体净化的过程和机理[23]，但相关研究仍远远不足，无法解释并解决植物修复技术存在的效果不稳定、环境因素影响大等问题。水体污染物的降解和转化，主要依赖于微生物的作用[24]，植物或微生物在水体应用过程中，与土著微生物之间的相互作用必然会影响水体微生态，并由此引起一系列的生态效应。本研究通过动态的河道污水流加，模拟了原位水体的交换过程，对水体主要水质指标的监测结果表明，整个系统在运行过程中存在一个变化到稳定的过程，相对于进水来说，整个模拟系统具有稳定的污染物去除效果。与之相对应，水体细菌群落结构亦处于动态的变化过程中，并最终趋同。细菌群落结构的变化必然引起其生态功能的变化[24]，这也是进出水差异的重要原因。

图4 水样中反硝化细菌在属水平上的相对丰度Fig.4 Relative abundance of dominant denitrifying bacteria at genus level in water samples at different time

图5 水样中反硝化细菌群落结构的主坐标分析Fig.5 Principal coordinate analysis from nirS gene sequences

鸢尾组的细菌群落结构变化显著异于其他各组的变化，显示其对水体细菌群落结构具有重要影响，既有研究[13，21]也有类似的结论。固定化净水菌在水体中是缓释过程，对水体细菌群落有显著影响[10]。在根部添加固定化净水菌的鸢尾组，细菌群落结构的变化更接近于只加固定化净水菌的实验组，说明固定化净水菌对水体细菌群落的影响大于鸢尾的影响。与此同时，鸢尾和固定化净水菌对水体细菌群落的影响存在一定的协同作用。

实验水体是当前区域典型的氮污染水体，对氨氧化和反硝化功能基因的高通量测序分析结果表明，体系中这些功能微生物的群落结构和多样性变化相对于总细菌较小。具有氨氧化功能基因的微生物主要集中在变形菌门和未分类的细菌中，而已知的氨氧化细菌种属的相对丰度极低，因而群落结构的变化也较小。这既可能是由于系统运行时间还未能满足氨氧化功能微生物的生长需求，也可能与本实验采用的功能基因测序分析技术手段有关。具有反硝化功能的微生物集中在变形菌门，其群落结构相较于初始阶段有一定变化，但保持了一定程度的稳定，这可能与实验生境溶氧较高、反硝化微生物活性不高有关。