葡萄酿制过程中5种杀菌剂的残留变化

章丽君，章 虎，徐明飞，林春绵，吴慧珍，徐 杰，钱鸣蓉，*

(1.浙江工业大学 环境学院，浙江 杭州 310032； 2.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021； 3.浙江树人大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310015)

食品安全问题日益成为全社会关注的焦点。农药在水果、蔬菜等食品中的残留问题是近年社会民生热点之一，葡萄酒中潜在的农药残留风险也不容忽视[1-4]。农药可用于保护作物免受外生生物的侵害，但过高的残留水平可能会对人体健康造成危害[5-6]。目前，中国国家食品安全标准中未有关于葡萄酒中农药最大残留限量(MRL)的规定。随着公众对食品安全标准要求的提高，以及家酿葡萄酒在民间的普及，有必要对典型杀菌剂在葡萄家酿过程中的残留变化进行研究，为家酿葡萄制酒过程中杀菌剂残留风险评估提供基础数据，以确保消费者的饮用安全。同时，针对家酿葡萄酒过程中杀菌剂残留变化的研究，也可作为优化家酿过程，降低杀菌剂在酒汁中残留量，促进家酿葡萄酒健康消费的重要依据。Cabras等[7]指出，葡萄酒中某些农药的残留水平不仅与药物化学性质有关，还与酿酒工艺中酵母菌的活性相关。此外，葡萄酒中农药残留还受酿造工艺、环境条件等因素的影响[8-10]。文献显示，葡萄酒在酿造过程中，酒泥中的农药残留水平远高于葡萄酒汁中[11-14]。本研究采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定腈菌唑、双炔酰菌胺、噁唑菌酮、丙环唑和苯醚甲环唑5种常见杀菌剂在葡萄家酿过程中的残留变化，并考查了酵母菌添加对其的影响，以期为相关研究提供基础资料与数据参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

红葡萄，取自杭州地区葡萄种植基地；RW安琪红葡萄酒果酒专用酵母，安琪酵母股份有限公司；D254酿酒酵母，法国Lalvin公司。固相萃取柱，HLB 6cc(200 mg)，Waters。色谱级甲醇，德国Merck公司；乙酸(纯度≥99.7%)，美国Sigma-Aldrich公司。杀菌剂标准品均购于德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司：腈菌唑，纯度99.5%；噁唑菌酮，纯度99.0%；双炔酰菌胺，纯度98.5%；丙环唑，纯度99.0%；苯醚甲环唑，纯度98.7%。

1.2 实验仪器

HPLC-MS/MS: Surveryor高效液相色谱，TSQ Quantum Discovery三重四级杆质谱，美国Thermo Fisher Scientific公司。QT-2型漩涡混合器，上海琪特分析仪器有限公司；KQ5200B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。BSA822-CW电子分析天平(精确至0.01 g)，德国Satorius公司。

1.3 实验方法

田间喷药。参照《农药登记残留田间试验标准操作规程》和杭州地区操作经验，依据气候和病害情况，在6月进行葡萄上的农药喷施。杀菌剂均以参照农药登记最高剂量的1.5倍施药：腈菌唑(美国陶氏益农公司40%可湿性粒剂)，用药量150 mg·kg-1，喷雾；噁唑菌酮(美国杜邦公司6.25%水分散粒剂)，用药量1 800倍液，喷雾；双炔酰菌胺(瑞士先正达作物保护有限公司23.4%悬浮剂)，用药量250 mg·kg-1，喷雾；对苯醚甲环唑和丙环唑，参照苯醚甲环唑最高剂量1.5倍施药(苯醚甲环唑和丙环唑混剂，四川贝尔化工集团有限公司30%水乳剂，苯醚甲环唑和丙环唑各15%)，用药量80 mg·kg-1，喷雾。每个处理设平行小区3个，每小区面积60 m2，另设对照区1个。

酿酒过程。采摘施药14 d后的成熟葡萄以及空白组(未施药)葡萄用于酿酒试验。用剪刀贴近果蒂处把葡萄剪下来，选取成熟、新鲜、无病虫、无腐烂，品质好的葡萄，去除瘪粒、霉粒、青粒。设3个实验处理：CK，施药葡萄发酵；D254，施药葡萄+D254酿酒酵母发酵；RW，施药葡萄+RW安琪红葡萄酒果酒专用酵母发酵，每处理重复3次。另取未施药葡萄作空白对照。具体操作如下：将5 kg葡萄样品挤破，葡萄肉和葡萄皮挤碎后放到主发酵容器中(装样量不超过容器的70%)，将发酵容器置于阴凉、通风、室温(25 ℃)条件下：1～9 d为初发酵过程，于第2天向各处理中加入0.1 kg白糖并搅拌均匀，并在D254和RW处理的发酵罐中分别加入1 g D254酿酒酵母或1 g RW安琪红葡萄酒果酒专用酵母，于第4天重复第2天的加糖和搅拌操作，初发酵期间每天用消毒过的玻璃棒搅动样品；9 d后为后发酵过程，利用虹吸法，用胶管将葡萄酒汁倒入二次发酵器，用细纱布过滤葡萄皮、籽、糟等，滤液并入二次发酵容器中，发酵容器留有1/10空隙，封盖处保留缝隙。按照以上发酵过程，在实验开始前，和实验开始后1、3、5、7、9、15、21、26 d分别取发酵汁液和初发酵过程中的葡萄渣样品，发酵酒汁样品不少于20 mL，葡萄渣样品不少于20 g，取样前充分振摇发酵容器。样品采集后，立即低温(-20 ℃)保存。

1.4 分析方法

样品前处理。葡萄酒汁样品经解冻后取5 mL于50 mL离心管中，加入10 mL去离子水涡旋混合，调节pH至3.6。离心后将15 mL混合液转移至HLB(200 mg)固相萃取柱中(使用前，先后用5 mL甲醇、5 mL乙酸调节pH至3.6的去离子水活化净化柱)，去离子水洗涤小柱后用5 mL甲醇洗脱，洗脱液经0.22 μm 有机滤膜过滤，用HPLC-MS/MS进行分析。称取葡萄渣样品15 g捣碎匀浆，加入15 mL经1%乙酸酸化的乙腈，混合物涡旋后超声15 min，再加入6 g无水硫酸镁、1.5 g无水醋酸钠，迅速振摇5 min，离心，将上层乙腈提取物转移至含有 50 mgN-丙基乙二胺(PSA)、50 mg C18和150 mg无水硫酸镁的离心管中，涡旋混合并离心，再取0.5 mL上层乙腈提取物转移至含有0.5 mL去离子水的离心管中，涡旋均匀，过0.22 μm有机滤膜后待测。HPLC-MS/MS分析条件详见表1。

2 结果与分析

2.1 分析方法验证

采用2.5、5、10、50、250 μg·L-1系列浓度构建标准曲线，外标法进行定量。以离子信噪比为3∶1和10∶1分别计算5种杀菌剂的检测限(LOD)和定量限(LOQ)。通过日内重复性和日间重复性确定方法的精确度，以相对标准偏差(RSD)表示。对于日内重复性，同一天分析添加浓度为2.5、5、50、250 μg·kg-1的样品5次；对于日间重复性，连续3 d分析添加浓度为2.5、5、50、250 μg·kg-1的样品。

将目标杀菌剂添加到空白葡萄酒汁及葡萄渣样品进行重复实验。结果表明，本文所用的检测方法具有良好的线性(R2>0.999)，在供试浓度水平下，5种杀菌剂在葡萄酒汁中的回收率为75.4%～112.5%(表2)，在葡萄渣中的回收率为87.1%～105.5%(表3)。

2.2 酿酒过程中5种杀菌剂的残留变化

如图1所示，家酿过程中无论是否添加酵母，腈菌唑和双炔酰菌胺残留水平都先下降再上升接着下降，之后处于较稳定水平。分析原因，可能是发酵前3 d速度较缓慢，酒汁中腈菌唑和双炔酰菌胺的含量受降解的影响；随着发酵进行，葡萄果肉中的腈菌唑和双炔酰菌胺逐渐迁移至汁中，所以在5 d时显示浓度升高；之后腈菌唑和双炔酰菌胺的降解幅度逐渐强于迁移作用，7 d时显示浓度下降；至9 d时，二者浓度又回升，尤其是添加酵母的处理，其酒汁中双炔酰菌胺浓度高于初始浓度；9 d后滤出葡萄渣，初发酵结束，杀菌剂浓度处于稳定水平。酒汁中的噁唑菌酮浓度先上升再下降然后趋于稳定。发酵3 d，可能由于果肉中噁唑菌酮的迁移起主导作用，残留水平呈上升趋势；之后随着发酵的进行，噁唑菌酮的降解作用逐渐占优势，残留水平开始下降。

表1HPLC-MS/MS分析条件

Table1HPLC-MS/MS analysis conditions

杀菌剂Fungicide色谱条件Chromatographic conditions色谱柱Column柱温Columntemperature/℃流速Flow rate/(mL·min-1)流动相Mobilephase质谱参数MS/MS conditions定量离子Quantita-tiveion碰撞能Collisionenergy/eV定性离子Qualita-tiveion碰撞能Collisionenergy/eV腈菌唑Luna C18250.290% CH3OH289>7015289>12520Myclobutanil(5 μm)噁唑菌酮392>3317392>23814Famoxadone双炔酰菌胺412>32815412>12527Mandipropamid丙环唑342>15929342>6931Propiconazole苯醚甲环唑406>25123406>18839Difenoconazole

表2五种杀菌剂在葡萄酒汁中的回收率

Table2Recovery rate of 5 fungicides in grape wine

杀菌剂Fungicide添加浓度Concentration/(μg·kg-1)日内回收率(n=5)Intraday recovery rate/%(RSD)1 d2 d3 d日间相对标准偏差(n=3)Interday RSD/%LOD/(μg·kg-1)LOQ/(μg·kg-1)腈菌唑2.593.4 (1.2)96.9 (1.8)91.8 (6.0)2.20.51.5Myclobutanil584.9 (2.3)86.9 (5.5)94.1 (5.7)7.25094.8 (4.4)94.1 (3.5)97.1 (7.9)0.4250108.9 (0.4)110.7 (1.8)108.6 (4.6)3.8噁唑菌酮2.582.8 (9.7)76.1 (1.9)75.9 (1.4)7.40.31.0Famoxadone575.4 (4.3)82.8 (8.6)86.2 (2.7)9.75076.7 (1.1)75.6 (7.1)83.5 (5.8)3.425076.7 (0.6)82.8 (9.8)85.6 (4.8)7.3双炔酰菌胺2.5102.5 (9.3)98.5 (8.8)98.1 (8.2)2.40.82.5Mandipropamid593.4 (2.7)96.9 (7.7)101.9 (0.4)4.45092.0 (2.3)94.2 (1.2)93.1 (3.1)1.225092.3 (1.3)96.0 (6.6)95.4 (7.5)2.1丙环唑2.5100.5 (9.5)107.8 (0.7)106.9 (1.8)4.40.51.5Propiconazole592.7 (4.6)96.2 (0.7)102.9 (8.5)8.650101.8 (2.1)104.9 (2.8)105.9 (0.9)1.525085.6 (8.5)89.8 (1.6)90.6 (2.8)3.0苯醚甲环唑2.598.2 (2.4)102.2 (3.3)103.2 (1.9)2.70.31.0Difenoconazole589.1 (4.5)94.9 (2.5)98.3 (5.7)5.450104.4 (7.7)112.5 (3.0)112.5 (3.1)4.225099.6 (5.2)103.7 (0.7)109.3 (6.5)4.7

回收率数据后括号中的数字表示相应的相对标准偏差。下同。

Data in bracket after recovery rate was the according relative standard deviation (RSD). The same as below.

表3五种杀菌剂在葡萄渣中的回收率

Table3Recovery rate of 5 fungicides in grape sediment

杀菌剂Fungicide添加浓度Concentration/(μg·kg-1)日内回收率(n=5)Intraday recovery rate/%(RSD)1 d2 d3 d日间相对标准偏差(n=3)Interday RSD/%LOD/(μg·kg-1)LOQ/(μg·kg-1)腈菌唑2.599.9 (1.7)96.2 (6.4)94.1 (6.5)3.00.51.5Myclobutanil598.2 (5.4)99.7 (8.9)99.6 (4.7)0.850103.7 (1.7)94.5 (6.7)96.6 (3.9)4.925098.6 (4.2)100.8 (0.7)100.7 (4.5)1.2噁唑菌酮2.597.4 (8.1)95.0 (7.5)95.7 (5.0)1.20.62.0Famoxadone597.4 (4.1)97.9 (1.6)98.3 (2.7)0.550101.2 (4.9)96.7 (3.1)100.4 (1.7)2.425097.8 (1.1)98.9 (2.5)100.0 (2.7)1.1双炔酰菌胺2.587.1 (9.2)101.7 (2.8)95.1 (8.0)7.30.31.0Mandipropamid598.2 (7.1)103.6 (9.1)99.9 (4.3)2.85096.5 (6.6)105.5 (2.9)92.7 (2.8)6.525099.0 (5.6)104.7 (9.2)99.7 (6.5)3.1丙环唑2.596.1 (7.6)93.4 (3.6)97.6 (5.6)2.10.31.0Propiconazole598.8 (5.2)96.1 (4.7)102.7 (4.7)3.35092.3 (5.9)92.7 (4.8)95.9 (2.6)2.025096.4 (6.5)93.5 (5.5)99.2 (2.0)2.8苯醚甲环唑2.597.4 (3.4)101.7 (3.8)93.8 (2.1)4.00.51.5Difenoconazole599.1 (2.5)95.9 (4.5)97.6 (7.5)1.650103.2 (5.7)100.4 (5.9)101.2 (6.1)1.425099.0 (5.6)95.7 (6.7)98.7 (5.4)1.8

图1 五种杀菌剂在葡萄家酿过程中的残留变化Fig.1 Dynamic changes of five fungicides residue in homemade wine fermentation process

丙环唑与腈菌唑及双炔酰菌胺的浓度变化趋势一致，而苯醚甲环唑浓度则一直呈下降趋势，于9 d后趋于稳定。

取初发酵结束时的葡萄渣，测定其中5种杀菌剂的残留量，结果如表4所示，各处理之间无显著差异。总体来看，添加酵母菌对葡萄酒家酿过程中5种杀菌剂的残留变化无显著改变，5种杀菌剂的残留变化差异可能主要源于其理化性状差异。

王玉路等[15]研究表明，初发酵(酒精发酵)过程中，发酵液中目标农药无明显降解，其降解主要发生在二次发酵和陈酿期过程。本研究显示，家酿初发酵过程中不同杀菌剂的迁移与降解有差异，且在二次发酵过程中，5种杀菌剂残留水平都呈现稳定趋势。这可能是因为不同研究所采用的酿造工艺不同。家酿葡萄酒步骤操作简单，且未使用亚硫酸进行杀菌抗氧化。

表4发酵9 d后葡萄渣中5种杀菌剂的残留量

Table4Residue levels of 5 fungicides in grape residue after 9 d fermentation μg·kg-1

3 结论

本研究以喷施药剂的葡萄为材料，探索了葡萄酒家酿过程中杀菌剂残留的动态变化。结果表明，在初发酵过程，不同杀菌剂呈现了不同程度的降解，至初发酵结束，腈菌唑和双炔酰菌胺在添加酵母菌的发酵体系中没有呈现明显降解趋势。在二次发酵过程中，5种杀菌剂残留含量趋稳。5种杀菌剂的迁移水平和降解趋势均存在差异，但添加酵母对其无显著影响。