鸡蛋磺胺间甲氧嘧啶残留研究

夏 魏，李祖光，杨 华，吉小凤，汪建妹，钱鸣蓉，*

(1.浙江工业大学 化学与工程学院，浙江 杭州 310014； 2.浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021)

磺胺间甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine， SMM)是磺胺类(sulfonamides， SAs)抗菌药之一，具有抗菌和预防细菌感染的作用，常用于畜牧业、兽医临床预防，以及细菌性疾病控制，以提高动物抗病力和改善生产性能[1-2]。然而该类药物的超剂量使用或滥用会使药物残留期延长，人类食用此类动物源性产品后，可能会增强对该类抗菌药物的耐药性，对人体健康有潜在危害[3-4]。

药物在动物体内一般经过吸收、分布、代谢和排泄4个过程，不同生物的残留消除规律有所不同[5]。目前，磺胺类药物在猪、猴、兔、鱼等动物体内的药代动力学研究均有报道[6-7]，但鸡蛋中磺胺间甲氧嘧啶残留消除规律的相关研究较少，仅在测定方法方面有部分报道。为保障鸡蛋质量安全，维护消费者利益，本研究采用蛋鸡投药模拟试验，收集停药后一段时间内的鸡蛋，测定鸡蛋中磺胺间甲氧嘧啶药物残留量，以期探析磺胺间甲氧嘧啶残留在鸡蛋中的消除规律，并给出相应的休药期建议，为实际生产过程中保障鸡蛋产品质量安全提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 药品及仪器

30%磺胺间甲氧嘧啶钠可溶性粉，浙江杭州爱力迈；色谱纯乙腈和甲醇，德国Merck公司；无水乙酸钠(纯度99.0%)，温州市化学用料厂；无水硫酸钠(纯度98.0%)，上海凌峰化学试剂有限公司；氯化钠(纯度99.5%)，广东光华科技股份有限公司；甲酸(纯度99.0%)，美国ACS恩科化学。试验用水为Milli-Q系统纯化水。磺胺间甲氧嘧啶标准品(纯度98.0%)，上海安谱实验科技股份有限公司。

磺胺间甲氧嘧啶标准液：准确称取适量药物，用甲醇溶解，配制成适当浓度的标准储备液。

QTRAP 6500超高效液相色谱串联质谱仪(UPLC-MS/MS)，美国AB SCIEX公司；T25匀浆机，德国IKA公司；EOFO-945616涡旋仪，美国Talboys公司；Biofuge Primo R离心机，德国Thermo Fisher公司。

1.2 饲养管理及给药方法

选取32周龄、体质量1.6 kg的笼养蛋鸡(品种为海兰白)开展试验。对照组(20只蛋鸡)自由采食和饮水(无药物添加)；试验组分为高剂量组(30只蛋鸡)和低剂量组(30只蛋鸡)，分别以标签推荐最高剂量及其1/2剂量开展试验，药物浓度分别为159 mg·L-1和79.5 mg·L-1，添加至蛋鸡饮水中。试验组蛋鸡自由采食和饮水(有药物添加)，连续喂药5 d后停药。休药期每天于同一时间点收集鸡蛋，并测定鸡蛋中磺胺间甲氧嘧啶的残留量，取样时间持续至鸡蛋中无药物残留检出。

1.3 采样及样品处理

停药期间，每天同一时间点收集所产鸡蛋，每个取样点各剂量组随机选取5个鸡蛋混匀为一个样品，制备5个重复，样品于-20 ℃冰箱冷冻保存。

称取1.00 g样品于50 mL离心管中，加入5 mL乙腈(含体积分数1%乙酸)，涡旋1 min，超声15 min，8 000 r·min-1离心3 min。上清液转移至装有0.5 g无水乙酸钠和2.0 g无水硫酸镁的50 mL离心管中，涡旋1 min，8 000 r·min-1离心3 min，取1.5 mL上清液于装有100 mg C18和150 mg无水硫酸镁的2 mL离心管中，涡旋1 min，10 000 r·min-1离心3 min，取0.5 mL上清液至装有0.5 mL去离子水的2 mL离心管中，混匀后，过0.20 μm微孔滤膜，进UPLC-MS/MS分析测定。

1.4 测定方法

色谱条件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm × 2.1 mm，1.7 μm)，柱温40 ℃，样品温度25 ℃，进样体积5 μL，流速0.2 mL·min-1，流动相为0.1%甲酸溶液+2 mmol·L-1甲酸铵水溶液(A)和甲醇(B)，具体洗脱程序见表1。

表1液相色谱梯度洗脱程序

Table1Gradient elution program of liquid chromatography

t/min流速Flow rate/(mL·min-1)流动相A、B体积比Volume ratio of mobile phase A to B00.295∶50.50.295∶51.00.275∶253.00.275∶2511.00.220∶8012.00.20∶10013.00.20∶10013.10.295∶515.00.295∶5

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描模式，多反应检测(MRM)模式，气帘气和碰撞气均为氮气，离子喷雾电压5 500 V，离子源温度450 ℃，雾化温度300 ℃。以一级全扫描质谱图中磺胺间甲氧嘧啶的准分子离子作为各自的母离子，对其进行碰撞诱导解离，以峰度较强的二级碎片离子作为各自的定量离子，以上述离子反应进行定量分析，具有较高的专属性。具体地：定量离子对281.2/156.1，碰撞能量26 eV，去簇电压87 eV，保留时间6.66 min；定性离子对281.2/108.1，碰撞能量38 eV，去簇电压87 eV，保留时间6.66 min。

1.5 方法验证

本试验采用外标法定量，配置系列磺胺间甲氧嘧啶标准溶液，浓度分别为0.1、1.0、5.0、20、100 μg·L-1，每个浓度重复3次，以标准工作溶液浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。以3倍信噪比计算的值作为检出限，以10倍信噪比计算的值作为定量限。在分析实际样品前，对其进行3个浓度水平(20、50、100 μg·kg-1)的加标回收试验，每个添加水平重复测试5次。

1.6 鸡蛋中磺胺间甲氧嘧啶残留在休药后的降解动力学分析

对休药后鸡蛋中磺胺间甲氧嘧啶残留量做一级反应动力学分析。试验数据用下式拟合：

Ct=C0e-kt，

(1)

(2)

式(1)、(2)中：Ct为t时测得鸡蛋样品中的药物浓度，C0为喂药期结束时(第1天)鸡蛋样品中该药物的浓度，k为消除速率常数，t1/2为净化半衰期。

2 结果与分析

2.1 方法验证

2.1.1 标准曲线

配制系列磺胺间甲氧嘧啶标准溶液，在设定好的仪器条件下进行测定，样品色谱图如图1所示。根据保留时间对应的峰面积(y)与其浓度(x)进行线性回归，磺胺间甲氧嘧啶在0.1～100 μg·L-1线性良好，回归方程为y=88 924x+42 202，决定系数R2=0.999 7(图2)。

2.1.2 检测限、定量限和回收率

经测算，本文检测方法的检出限为0.03 μg·kg-1，定量限为0.1 μg·kg-1，试验条件下磺胺间甲氧嘧啶的回收率为80.9%～101.9%，相对标准偏差为2.2%～11.5%，方法稳定可靠。

2.1.3 基质效应

图1 鸡蛋样品中磺胺间甲氧嘧啶的提取离子流色谱图Fig.1 Extracted ion chromatogram of sulfamonomethoxine in egg sample

图2 UPLC-MS/MS测定磺胺间甲氧嘧啶的标准曲线Fig.2 Standard curve of sulfamonomethoxine detected by UPLC-MS/MS

鸡蛋富含各类营养物质，如脂肪、蛋白质等，对目标物的测定可能会产生一定影响。为了解鸡蛋样品基质对磺胺间甲氧嘧啶残留定量测定的影响，对基质效应进行评价。首先，选择未检出的阴性样品按照1.3节方法进行净化处理后，在基质液中加入标准溶液，浓度分别为0.1、1.0、10、20、50、100 μg·L-1，然后对基质标准溶液进行测定，得到回归方程y=95 957x+42 371，R2=0.999 5。将该斜率值与同系列标准溶液回归曲线方程的斜率值进行比较，两者的比值为0.93，说明通过前处理方法获得的样品中基质效应较小，可采用基质标准溶液直接进行定量分析。

2.2 休药后鸡蛋中磺胺间甲氧嘧啶残留变化

对照组鸡蛋样品中无残留检出。如表2所示，随着休药时间延长，鸡蛋中磺胺间甲氧嘧啶残留量逐渐降低，直至低于检测限，高剂量组的鸡蛋中药物残留消除时间明显长于低剂量组。高剂量组在休药后第1、3、5、10、16、20、24天，磺胺间甲氧嘧啶残留量分别为2 497.3、220.1、38.9、6.0、1.3、0.5、0.1 μg·kg-1；低剂量组在休药后第1、3、5、10、16天，磺胺间甲氧嘧啶残留量分别为694.3、45.2、15.5、1.5、0.1 μg·kg-1。参照原农业部2002年第235号公告，禽肉中磺胺间甲氧嘧啶最大残留限量为100 μg·kg-1，则高剂量组在休药后第5天、低剂量组在休药后第3天，鸡蛋中的磺胺间甲氧嘧啶残留量即低于此规定，综合来看，休药期建议在5 d以上。若参照方法检测限，要获得磺胺间甲氧嘧啶残留无检出的鸡蛋，休药期建议在25 d以上。

表2休药后鸡蛋磺胺间甲氧嘧啶的残留量(n=5)

Table2Residue of SMM in egg without sulfamonomethoxine injection(n=5)

休药后时间Withdrawalperiod/d磺胺间甲氧嘧啶残留量SMM residue content/(μg·kg-1)高剂量组High-dose group低剂量组Low-dose group12497.3±440.78694.3±137.742341.5±57.50124.1±13.043220.1±40.8145.2±7.874100.5±16.5426.1±4.78538.9±6.9215.5±2.75624.6±4.6110.7±2.12712.1±1.906.1±0.6888.9±1.133.1±0.5697.3±1.062.0±0.39106.0±1.101.5±0.17114.5±0.740.9±0.14132.6±0.510.7±0.10161.3±0.220.1±0.02181.0±0.17—200.5±0.09—220.4±0.06—240.1±0.01—26——

2.3 鸡蛋中磺胺间甲氧嘧啶残留的消除规律

高剂量组，磺胺间甲氧嘧啶在前4 d消除较快，残留量下降了98%以上；低剂量组，磺胺间甲氧嘧啶在前2 d消除较快，残留量下降了97%以上。经测算：高剂量组的消除速率常数(k)为0.4 μg·kg-1·d-1，t1/2为1.9 d；低剂量组的消除速率常数(k)为0.6 μg·kg-1·d-1，t1/2为1.2 d。在不同的给药剂量下，鸡蛋中磺胺间甲氧嘧啶的消除速率常数和半衰期不同，这可能是由于不同剂量的磺胺间甲氧嘧啶对动物体肝药酶系统活性产生了影响，或者可能是因为不同剂量的磺胺间甲氧嘧啶在鸡蛋中的药动学行为呈某种线性关系，如刘晓晖等[8]在大鼠体内进行不同剂量红景天苷的研究中发现，剂量与药动学行为有线性关系。相关原因还须进一步分析确认。

3 讨论

本研究利用QuEChERS方法进行前处理，建立了UPLC-MS/MS测定鸡蛋中磺胺间甲氧嘧啶残留的检测方法。该方法操作简单，提取效果和稳定性良好，适用于大批量样品的检测分析，可为鸡蛋中磺胺类药物的残留风险评估提供方法借鉴。利用该方法通过蛋鸡投药模拟试验对鸡蛋中磺胺间甲氧嘧啶残留消除规律进行研究，结果表明，高剂量投药组鸡蛋磺胺间甲氧嘧啶的半衰期长于低剂量组，低剂量投药组鸡蛋磺胺间甲氧嘧啶的消除速率快于高剂量组。为确保鸡蛋产品的质量安全：若参照原农业部相关规定，本试验剂量下的安全休药期建议为5 d以上；若参照本试验方法最低检测限，建议休药期在25 d以上。

目前，QuEChERS[11]方法已广泛应用于食品和环境样品的前处理中。Wen等[12]在5.0 g样品中加入15 mL含1%(体积分数)乙酸的乙腈溶液，结合分散固相萃取(dSPE)对多种动物组织(牛肉、猪肉、鸡肉、牛肚和猪肝)中磺胺类药物进行提取，以液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定，取得了良好的结果，样品回收率为74.0%～100.3%，检测限为0.01～12.5 μg·kg-1，精确度为0.4%～10.5%。该方法可应用于脂肪含量较高的生物样品，但还未在鸡蛋样品中进行过验证。Huertas-Pérez等[13]采用QuEChERS前处理方法对鸡肉和鸡蛋中多种抗生素类药物进行提取，称取5.0 g样品加入5 mL水和10 mL含有1%(体积分数)乙酸的乙腈溶液，离心后取3 mL液体至Z-Sep净化管中，氮吹定容，以液相色谱法(HPLC)测定，回收率为65.0%～88.1%，定量限为14～85 μg·kg-1。本研究在QuEChERS方法的基础上，优化了称样量，采用通用的净化材料，建立了适用于鸡蛋中磺胺间甲氧嘧啶的测定方法。与上述2种方法相比，本试验方法的回收率更高，灵敏度更高。这主要是因为本试验操作步骤少，减少了提取净化过程中的损失，且使用的UPLC-MS/MS仪器灵敏度高。