动脉灌注化疗栓塞联合放射粒子植入治疗原发性肝癌患者疗效及其对肝组织TRF1和TRF2表达的影响*

陈 向，汪宝林，吴 琛，唐劲草，张 弛，褚朝顺

动脉灌注化疗栓塞术（TACE）是针对肝脏肿瘤的有效治疗方法，疗效确切，已经得到广泛的应用，但单纯TACE治疗的远期疗效并不理想[1～3]。肿瘤病灶内125I放射粒子植入是一种可以对病灶精确定位的新型放疗手段，能够有效提高局部病灶的放射剂量。目前，关于TACE联合放射粒子植入治疗原发性肝癌（PLC）患者的临床应用报道较多，且疗效肯定[4]。端粒重复序列结合因子（telomeric repeat binding factor 1/2，TRF1/2）是调节端粒结合蛋白，对维持端粒的正常结构和功能非常重要[5]，对于肿瘤细胞DNA复制、染色体运动和端粒长度的调节等生物学活动也具有重要的意义，与多种肿瘤的发生、病情进展和转移密切相关[6]。本研究探讨了TACE联合放射粒子植入术治疗的PLC患者肝组织TRF1和TRF2表达的变化，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2012年12月～2015年12月我院和南京医科大学第一附属医院接受治疗的PLC患者108例，男66例，女42例；年龄38～71岁。符合原发性肝癌诊断标准[7]。肿瘤形态为弥漫型18例，结节型40，块状型50例；Child A 级30例，B级66例，C级12例。纳入患者均未接受过任何放疗和化疗治疗，预计生存时间大于6个月，经影像学检查未发现其它部位转移。排除标准：（1）存在TACE治疗禁忌证；（2）血白细胞计数小于3.0×109/L、血小板计数小于80×109/L；（3）存在心血管系统疾病或肾功能损害者；⑷存在其他部位恶性肿瘤。采用掷硬币法将患者随机分为对照组54例和观察组54例，两组年龄、性别、肿瘤形态、Child分级等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究方案经我院医学伦理委员会批准。患者签署知情同意书。

1.2 治疗方法 在对照组，行TACE治疗，行局部麻醉后，经股动脉穿刺插入导管，造影确认肿瘤位置、大小、数目，明确相关供血动脉情况，缓慢注射吡柔比星（深圳万乐药业有限公司，国药准字H10930105）20～40 mg，奥沙利铂（江苏奥赛康药业股份有限公司,国药准字H20051985）50 mg和碘化油，取吡柔比星20 mg与48%碘化油10 ml比例混合，碘化油用量为10～15 ml。术后采取常规护肝治疗；在观察组，行放射粒子植入术联合TACE治疗，在TACE治疗1周后，将患者体位固定，行CT平扫，明确肿瘤大小、位置、癌旁组织结构，在体表标记。将CT扫描数据、125I治疗剂量和125I放射粒子活性等参数传输至计算机系统。采用Dany CT确定临床治疗靶区，并根据CT导航系统进行定位穿刺，确认针尖穿刺至治疗靶区后，通过针鞘将已确定剂量的125I放射粒子植入。再次行CT扫描复查，观察放射粒子分布情况，术毕，拔出穿刺针，对穿刺部位进行消毒、包扎。两组患者均实施3～4次TACE治疗，观察组仅进行1次放射粒子植入，治疗结束后随访12 m。

1.3 临床疗效评估 采用世界卫生组织关于实体肿瘤疗效的评定标准[8]评定疗效，即完全缓解（CR）：所有病灶消失；部分缓解（PR）：病灶体积减少至少50%；病情稳定（SD）：体内肿瘤病灶体积减少小于50%或增加不大于25%；进展或恶化（PD）：病灶体积增加至少25%或出现新的病灶。客观缓解率(RR)为CR和PR之和除以总例数（×100%）。

1.4 血清肿瘤标志物检测 采用ELISA法测定血清癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）和甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）水平，试剂盒购自联科生物科技有限公司。

1.5 肝癌组织TRF1和TRF2表达检测 分别于治疗前和治疗1月后行肝活检穿刺检查，获取肝组织，采用免疫组化染色（S-P）法检测。鼠抗人TRF1单克隆抗体和兔抗人TRF2单克隆抗体及其配套试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。由两名病理科医生阅片，遵循随机单盲原则，在400倍下避开切片边缘选取5处不重叠视野观察，计数TRF1和TRF2阳性细胞数。阳性判断标准[9]：细胞浆或细胞核内见棕黄色或棕色颗粒分布者，判定为阳性；阴性判断标准：胞浆内无棕黄色颗粒染色为阴性。采用半定量综合评分法对TRF1和TRF2的表达进行评估，评估标准：染色积分=染色强度分数×染色细胞百分比；细胞染色计分：0分为无染色细胞，1分为阳性细胞小于10%；2分为染色阳性细胞在11%～50%；3分为50%～75%，4分为超过75%的细胞染色阳性；染色强度：0分为无染色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。综合评分：0～2分为不表达，记为阴性；3～5分为弱表达，记为弱阳性；6～8分记为中等阳性；9～12分记为强阳性。

1.6 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件对本研究数据进行统计分析,计数资料采用x2检验，计量资料以（±s）表示，采用 t检验。以 P＜0.05 被认为差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 临床疗效比较 在治疗后3 m，观察组客观缓解率显著高于对照组（x2=4.441，P＜0.05，表1）。患者男性，46岁。肝右叶见巨大占位，约13.3×16.1 cm，边界欠清，增强呈快进快出，内见坏死区，肝门部见多发稍大淋巴结；在介入治疗术后，肝右叶巨大占位较前缩小，最大截面约为10.1×13.3 cm，周围肝实质密度降低，病灶内可见斑片状致密影和少许气体样密度，增强后未见明显强化，肝门处和腹主动脉周围可见多发稍大淋巴结。

表1 两组近期疗效[(n)%]比较

2.2 两组血清CEA和AFP水平比较 在治疗3月时，观察组血清CEA和AFP水平显著低于对照组（P＜0.01，表2）。

表2 两组血清CEA和AFP水平(±s)比较

表2 两组血清CEA和AFP水平(±s)比较

与对照组比，①P＜0.05

例数 CEA(ng/ml) AFP(μg/L)对照组 治疗前 54 520.6±55.2 2420.2±290.3治疗后 54 312.5±33.9 1080.1±121.3观察组 治疗前 54 526.1±51.1 2371.4±245.2治疗后 54 273.7±38.1② 820.4±130.3②

2.3 两组治疗前后肝组织TRF1和TRF2表达的比较 观察组癌旁肝组织TRF1表达量为（9.7±2.3），显著高于癌组织的【（4.2±1.8），P＜0.01】，而观察组癌组织TRF2表达量为（9.2±2.2），显著高于癌旁肝组织的【（3.8±2.6），P＜0.01，图1～图3】。

图1 癌旁肝组织TRF1阳性表达在细胞浆中可见棕褐色颗粒（SP，400×）

图2 肝癌组织TRF1呈轻度阳性表达（SP，400×）

图3 肝癌组织TRF2阳性表达在细胞核和细胞浆中可见棕褐色颗粒（SP，400×）

2.4 两组生存率比较 观察组1 a生存率显著高于对照组 [96.3%（52/54）对 85.2%（46/54），x2=3.967，P=0.046]。

3 讨论

本研究采用TACE联合放射粒子植入术治疗PLC患者客观缓解率为79.6%，明显高于对照组的61.1%。分析认为肝动脉为肿瘤的主要供血动脉，TACE通过对肝动脉注入化疗药物，对肿瘤细胞具有直接的杀伤作用，同时还能阻断病灶的供血，促进肿瘤凋亡[10]。放射粒子植入术能够精确定位肿瘤靶区域，局部大剂量放疗能够大大提高临床疗效。两者作用机制不同，联合使用能产生发挥协同作用，且经TACE治疗后能够有效改善肿瘤细胞对放疗的敏感性，进而提高临床治疗效果[11，12]。

研究发现，细胞端粒功能异常是导致细胞异变，继而引发癌症发生的重要原因[13，14]。端粒的结构和功能与细胞在增殖过程中DNA复制、细胞老化、细胞程序性死亡密切相关。恶性肿瘤细胞核内具有生物学活性较高的端粒酶，导致端粒的结构和功能异常，实现肿瘤细胞在一定程度上的持续性增长，是导致病情发生和恶化的重要因素。TRF1和TRF2是影响细胞端粒结构、活性和功能的重要蛋白。TRF1能够特异性调节结合DNA的端粒数量，从而对端粒长度实现负性调节作用，而TRF2的生物学功能是维持端粒结构稳定，保持端粒长度的动态平衡，影响细胞的增殖和凋亡。国外研究表明，恶性肿瘤组织TRF1的表达明显降低而TRF2较正常组织明显增高[15]。国外研究学者发现PLC患者TRF1和TRF2异常表达为PLC发病的独立危险因素，TRF1和TRF2表达水平与临床分期密切相关。他们认为对患者血TRF1和TRF2含量进行动态监测，对于疾病的诊断、病情及预后的评估具有重要意义[16]。Bouhlel L et al[17]指出，非小细胞肺癌患者血TRF2水平较健康对照人群明显增高。因此，探讨临床常用治疗方案对肝癌患者TRF1和TRF2表达的影响，对于临床治疗以及预后预测具有重要意义。采用TACE联合125I治疗能够明显调节患者肝组织TRF1和TRF2表达。原发病灶肿瘤边缘血管重建和肿瘤细胞增殖等活动中均有TRF1和TRF2的参与，进而影响肿瘤细胞增殖过程中的DNA复制。肝癌患者外周血TRF2呈异常增高，TRF1明显下降。肝动脉为肝肿瘤主要的血供来源，TACE将化疗药物直接灌注到相关肿瘤供血血管，阻断病灶血供，抑制血管增生，促进细胞凋亡，相关因子明显下降。TACE联合放射粒子植入术治疗患者病灶治疗区域局部放疗剂量较高，射线能直接破坏肿瘤细胞DNA双链结构，另一方面通过放射治疗使水分子电离生成自由基，对肿瘤细胞DNA同样具有杀伤作用，能够有效抑制肿瘤细胞的分裂、生长，能防止病情的恶化和转移，且对于病灶边缘区域内的残留组织供血，TACE无法直接阻断，而放疗则可以有效杀灭该区域的肿瘤细胞。此外，相关研究已经证实125I放射粒子植入能够改善肝癌患者机体免疫功能，增强自身防御机制[18]。两种方案联合治疗无交叉耐药，同时能够提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，增强化疗的疗效，抑制肿瘤血管的新生，缩小病灶体积，改善患者的预后。