一种新生大鼠肝细胞分离改良方法的建立*

郭丽平，张成宏，宁宝烁，许 敏，徐贝贝，王 雪，李异玲

肝脏是人体内最大的内脏器官，肝实质细胞是肝脏主要的构成细胞，其中肝细胞（hepatocyte，HC）约占肝脏总质量的60%～80%，发挥胚胎造血、蛋白质合成、胆汁酸生成、糖原储存、解毒、新陈代谢等重要的生理功能。部分肝叶切除术或细胞毒性损伤后体内的HC可再生补充受损的肝细胞[1，2]，而体外HC生长活性较差，对于肝脏病理生理、药物代谢、基因治疗等研究造成了一定的阻碍。1969年，由Berry和Friend[3]首先采用两步胶原酶灌注法分离完整的HC，经研究者不断改良，近50年来国内外公认获取大鼠原代HC的方法为Segalen经典两步原位灌流法[4]，但这种方法适用于体型相对较大的动物，如成年大鼠、成年小鼠，乳猪等动物，便于进行动静脉穿刺灌流并能够获得可观的细胞数量。成熟大鼠原代HC在体外几乎很难增殖，同时这种方法要求特殊的仪器、大量胶原酶和穿刺技术等多种条件,增加了实验的难度。我们参考Charlotte et al[5，6]的实验方法，建立了一种改良后大鼠原代HC分离技术，即在出生1～3天的大鼠，采用多步酶消化法及组织块贴壁法分离大鼠原代HC，单层细胞培养原代HC。此法简单、易操作，可保持一定的肝细胞数量和活力，也便于普通实验室应用。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和仪器 出生1～3天SPF级SD大鼠，体质量60±10 g，雌雄不限（购于辽宁省长生生物技术公司）。Ⅳ型胶原酶（Sigma公司），0.25%Trypsin-EDTA（Gibico公司），DMEM高糖培养基（BI公司），胎牛血清（BI公司），抗CK-18抗体（PTG公司），鼠/兔二抗（迈新公司），DAB显色试剂盒（迈新公司），台盼蓝（Sigma公司），糖原染色试剂盒（Solarbio公司），PBS缓冲液，0.9%氯化钠溶液。倒置显微镜（Olympus公司），离心机（赫西仪器公司），水浴锅（瑞华仪器公司），孵箱（ESCO公司），血细胞计数板、盖玻片、200目一次性筛网、烧杯、15 ml离心管和50 ml离心管等。

1.2 肝细胞分离与培养 将出生1～3 d大鼠酒精浸泡1 min消毒，断头处死，小心取出肝脏，注意尽量不要剪到肝脏结缔组织，用PBS缓冲液冲洗1遍，剪碎至1～3 mm3大小，PBS缓冲液反复冲洗，至组织上清几乎为透亮溶液。弃上清，加入0.25%Trypsin-EDTA 37℃水浴消化5 min，加入完全培养基终止消化，弃上清，用PBS缓冲液洗涤剩余培养基，弃上清。继续加入0.03%Ⅳ型胶原酶37℃水浴消化10 min，用PBS缓冲液立即稀释胶原酶浓度，收集上清液于离心管，置于4℃。再用PBS缓冲液冲洗、吹打组织块，收集剩余细胞，重复胶原酶消化步骤2次，将收集的所有上清液与组织经200目细胞筛网过滤，50 g离心3 min，重悬细胞悬液。将收集好的细胞沉淀加入含15%血清的DMEM高糖培养液于A培养瓶中培养，在48 h首次换液时，保留四分之一原液，再加入新完全培养液继续培养，每2 d换液1次。将剩余组织块于B培养瓶中共同培养，48 h首次换液，轻轻吹打瓶底，弃掉未贴壁组织块，方法同A瓶加入培养液，继续培养。取细胞悬液，以0.4%台盼蓝1：9染色，在显微镜下用血细胞计数板计数细胞，一只新生大鼠每次可获得约1～2×106单个细胞，接种细胞瞬时活率为78.5±6.5%之间。A培养瓶：48 h换液，可见大约20%～30%左右的细胞贴壁，分布呈单个或3～5个细胞连成片状，细胞较大、透亮、伸展良好、呈多边形，可见为单核或多核，胞质内可见较多的分泌物。在实验中发现，呈片生长的细胞增殖较快，而单个细胞生长相对缓慢，约3～5 d长满瓶底的70%～80%，细胞呈集落生长，逐渐相互靠拢挤压，形成规则大片状分布；B培养瓶：48 h换液后，可见部分组织块贴壁较紧，部分细胞贴壁伸展如A瓶，3 d左右组织块附近开始出现生长晕，细胞爬出较多，细胞之间紧密连接，约3～5 d可长满瓶底的70%～80%。B瓶中细胞形态相对A瓶中较多样，有典型的肝细胞形态、亦混杂少量星状细胞、枯否细胞等非实质细胞，再采用选择性贴壁法纯化肝细胞。经过传代后，细胞形态开始发生变化，逐渐成“纤维样”形态细胞。

2 结果

HC爬片：将长满瓶底70%～80%细胞经0.25%Trypsin-EDTA消化90 s，制成细胞悬液，传于爬片之上，待24 h后，细胞几乎全部贴壁，进行染色鉴定。

2.1 糖原染色 将HC爬片置于Canoy固定液，4℃冰箱内固定1 h。用0.9%氯化钠溶液清洗3次后，用滤纸吸干，将细胞爬片置于PAS试剂盒，加过碘酸氧化水溶液，避光反应10 min，用0.9%氯化钠溶液洗涤3次，将细胞爬片置于Schiff液中，于37℃水浴锅内避光反应20 min后，用0.9%氯化钠溶液洗3次，最后经苏木素复染10 s左右，用流水冲洗爬片，直到背景色被去除，晾干后在镜下观察。在低倍镜下，可见HC多为双核或多核，胞质呈粉色，胞核呈深蓝色；在高倍镜下，在HC胞质中可见密集粉红色的糖原颗粒（图1、图2）。

图1 HC爬片 培养第5 d，HC多为双核或多核，胞质呈粉色，胞核呈深蓝色（PAS,100×）

图2 HC爬片 培养第5 d，可见HC胞质中密集呈粉红色的糖原颗粒，糖原染色阳性比率＞95%（PAS,400×）

2.2 免疫组化染色 将HC爬片于冷丙酮（提前1 h置于4℃冰箱）中固定20 min，用0.9%氯化钠溶液浸洗3次，将30 ml/L过氧化氢与纯甲醇按l：50混合后，室温浸泡肝细胞爬片30 min，用0.9%氯化钠溶液洗3次，滴加封闭液5%BSA，室温下封闭10 min，吸去多余液体，加1：200稀释的兔抗大鼠CK-18多克隆抗体,37℃孵育30 min,用0.9%氯化钠溶液清洗3次，再滴加聚合辣根过氧化物酶标记的抗兔 IgG，37℃孵育 30 min，PBS冲洗3次，DAB显色，反应10 min，用0.9%氯化钠溶液冲洗3次，滤纸吸干，苏木素复染10 s左右，流水冲洗爬片，直到背景色被去除，晾干后在镜下观察。在低倍镜下，可见胞质呈均质棕黄色，胞核呈蓝色；在高倍镜下，可见细胞内清晰棕色颗粒和蓝色胞核（图3、图4）。

图3 HC内CK-18表达 第5d，可见胞质呈均质棕黄色，胞核呈蓝色（SP，100×）

图4 HC内CK-18表达 第5 d，可见细胞内清晰的棕色颗粒和蓝色胞核，棕色部分染色＞95%（SP，400×）

3 讨论

肝脏是人体的代谢中心，体外培养的HC是用于研究肝病的常用方法。目前，国内外应用最多的是两步原位胶原酶灌注大鼠肝脏，获得的肝细胞数量可观[7]，但成熟肝细胞在体外几乎不增殖，细胞活性也很快下降[8]，对于后续研究及实验观察造成了一定的阻碍。据Crawford[9]和Wu et al[10]报道，新生大鼠HC是一种中度分化的细胞，兼具肝祖细胞和成熟HC的特性及功能，且新生大鼠HC增殖能力相对较强，是研究HC功能及肝脏病理生理等变化的最佳选择之一。

实验发现，HC是一种极其脆弱的细胞。我们首先尝试了单用0.25%Trypsin-EDTA消化肝组织，但胰酶作用过于剧烈，作用时间不易把握，导致细胞活率及产量很不稳定。胶原酶只消化细胞间质部分，对细胞损害相对较弱。实验发现，胶原酶处理组织块10～15 min不会影响后期细胞存活率，且其浓度以0.03%为宜，既可以保证细胞产量，也不至于对细胞造成不可修复的损伤。经过反复实验，我们探索一种改良的方法，即先用胰酶+EDTA预处理肝组织块5 min，弃上清（可能包含肝包膜成纤维细胞），经过PBS洗涤，继续使用Ⅳ型胶原酶消化剩余消化组织块2次，每次10 min，分离HC。因组织体积较大，密度较高，运用低速梯度离心可基本去除死亡的肝细胞、细胞碎片及非实质细胞。结合单层细胞培养及组织块贴壁培养法,可以获得足够数量的肝细胞，与既往报道一致[11]。因酶消化呈中心性消化，每次消化后的组织块需要进行充分的洗涤，防止已脱离纤维连接的细胞二次受损。HC悬液于4℃冰箱暂保存，防止细胞活性下降。实验发现，细胞活率和体外操作时间呈反比关系。对于体外操作时间，我们建议不超过2 h，可确保后期细胞贴壁。若体外操作时间大于3 h，培养细胞24 h甚至48 h，基本无肝细胞贴壁。

实验中还发现，48 h首次换液较24 h首次换液，贴壁的细胞更多，与以往的研究略有差异[12]，考虑可能受损的HC恢复其细胞膜的完整性较慢，相对需要较长时间适应新的环境。经观察，48 h换液细胞组增殖能力明显强于24 h首次换液组。在首代培养的HC，待长至培养瓶底70%～80%时传代，目的是通过选择性贴壁去除组织块及枯否细胞、成纤维细胞等贴壁力较强的间质细胞[13]，传代时注意控制消化时间，吹打力度适中。HC基本可稳定传3～4代，之后细胞生长速度明显减缓。1个月左右，细胞基本不再生长，出现凋亡现象，逐渐变为空泡纤维网状或细胞裂解、凋亡。

肝细胞培养的方式有多种，最常见的有单层细胞培养、与肝非实质细胞共培养[14]、球状模型培养[15]、“三明治”模型培养[16]等多种方法。在本实验中，我们采用单层细胞培养，也取得了较好的效果。

据文献报道[17，18]，HC在体外培养时逐渐失去上皮表型，开始退化或向成纤维化表型转变。在本实验中也观察到相似的情况，在普通条件培养下，经过传代后HC逐渐呈“纤维样”形态，但糖原和CK-18表达仍呈阳性。Payushina et al[17]提出小鼠胎鼠HC是一种多功能的间充质干细胞。胎鼠HC经过标准的原代培养及传代后，上皮细胞逐渐消失[17，18],猜测一方面可能是在标准培养条件下，成纤维细胞较上皮细胞竞争力更强；另一方面，可能是上皮-间质转化导致初始表型丧失。Mansuroglu et al[19]在研究大鼠胎鼠特异性表达基因时观察到，传代后的大鼠胎HC不是功能性成熟肝细胞，不仅HC标志物（Prox1）的表达消失了，而且丧失了HC的白蛋白合成和AFP分泌功能。与此同时，剩余大部分细胞为Desmin阳性/α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，SMA）阳性的成肌纤维细胞，少量Desmin阳性/SMA阴性HC。成肌纤维细胞最有可能来自于胎鼠肝血管壁的间充质细胞群，而不是上皮-间充质转变的结果。然而，上述情况尚未得到充分的证实，需进一步完善相关研究，为肝脏病理生理、毒药物检测以及生物人工肝的研究提供更多的细胞保障。有报道，成熟的HC具有可塑性，可去分化形成肝祖细胞，可能为将来肝脏疾病的治疗产生重大影响[20]。