自体外周血干细胞移植治疗乙型肝炎肝硬化患者临床疗效及其对外周血T淋巴细胞亚群的影响

王 禅，秦 伟，戴 勇，李晓峰，张成强

乙型肝炎肝硬化是一种常见的慢性肝病，其肝组织病理学表现为纤维组织增生、结构破坏，假小叶形成。研究发现，在急慢性肝损伤及修复过程中，干细胞的再生起着重要的作用[1，2]。近年来，干细胞移植技术在治疗乙型肝炎肝硬化方面取得了一定的成就，且有相关研究发现，应用自体外周血干细胞（peripheral blood stem cells，PBSC）移植治疗肝炎肝硬化患者取得了一定的疗效[3，4]。自体PBSC是一种未成熟的细胞，可在一定条件下分化为具有不同功能的组织细胞，可以进行自我复制和更新。自体PBSC移植治疗肝炎肝硬化主要是利用其具有多项分化潜能，可以在适当环境下向肝细胞分化的特点，该治疗方法明显提高了患者的生活质量。作为一项新技术，其应用前景较好[5，6]。本研究应用自体干细胞移植治疗乙型肝炎肝硬化患者，观察了其疗效情况，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2014年4月～2017年4月我院治疗的乙型肝炎肝硬化患者95例，男性63例，女性32例；年龄32～65岁，平均年龄（51.6±8.1）岁。诊断符合慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）[7]的标准，并经B超、CT等影像学检查诊断为肝硬化。Child-Pugh A级33例，B级34例，C级28例。排除标准：（1）近期应用过免疫抑制剂或糖皮质激素；（2）严重的全身感染；（3）有家族遗传性肝病史者。将入选患者随机分为两组，两组性别（x2=0.632，P=0.426）、年龄（t=1.575，P=0.115）和 Child-Pugh 分级（x2=1.893，P=0.388）等一般资料比较，差异无统计学意义，具有可比性。患者签署知情同意书，本研究已获得我院医学伦理委员会批准实施。

1.2 治疗方法 给予两组护肝、降酶和恩替卡韦抗病毒治疗。部分患者在此基础上，给予自体PBSC移植治疗。给予人粒细胞集落细胞刺激因子皮下注射，连续2 d。术前1 d，行碘过敏试验，双侧腹股沟备皮。使用德国费森尤斯公司生产的COM-TEC血细胞分离机行外周血血细胞分离，按Auto-MNC程序，安装一次性血细胞分离管路，连接血细胞保存液及抗凝剂，机器自动检测，预充，在患者双侧肘正中静脉置入留置针，分离血细胞70～80 ml。采集完成后，在数字减影血管造影下经股动脉穿刺插管，经肝固有动脉造影，观察肝内血管情况。排除肝内占位后，将采集的干细胞悬液缓慢注入肝动脉，术后拔管，穿刺点加压包扎，返回病房，穿刺侧下肢制动24 h。

1.3 临床检测与检查 使用Beckman Coulter FC500全自动流式细胞仪检测外周血T细胞亚群；使用法国Echosens公司生产的Fibroscan仪检测肝脏硬度；采用Child-Turcotte-Pugh评分系统评价肝功能[8]；采用ELISA法检测血清肿瘤坏死因子（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）；采用免疫透射比浊法检测血清超敏C反应蛋白（hypersensitive C reactive protein，hs-CRP，试剂盒购于北京东亚免疫技术公司）；使用美国贝克曼库尔特公司生产的CX7生化分析仪检测血生化指标。

1.4 统计学分析 应用SPSS 18.0软件行统计学分析，计量资料均符合正态分布，以（±s）表示，组间两两比较采用独立样本t检验；计数资料用[（n，%）]表示，采用 x2检验；不同时间资料的比较采用重复资料的方差分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗前后肝功能指标变化比较 治疗前，两组血生化指标比较无显著性差异（P＞0.05）；在治疗后3 m和6 m，移植组患者血清TBIL显著低于，而血清ALB水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

2.2 两组治疗前后外周血T淋巴细胞亚群变化的比较 治疗前，两组外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值比较均无显著性差异（P＞0.05）；治疗后，移植组CD3+、CD4+和CD4+/CD8+比值均显著高于对照组（P＜0.05，表2）。

表1 两组肝功能指标（±s）比较

表1 两组肝功能指标（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05

例数TBIL（μmol/L）ALB(g/L) INR移植组 移植前 48 27.5±3.9 26.5±3.6 1.4±0.8移植3 m 48 22.7±2.5① 30.8±3.7① 1.3±0.6 6 m 48 16.4±1.2① 35.2±4.0① 1.2±0.5对照组 治疗前 47 27.9±4.1 26.1±3.5 1.3±0.9移植3 m 47 25.4±3.7 28.3±3.9 1.2±0.7 6 m 47 22.5±2.6 31.6±3.7 1.3±0.4

表2 两组外周血T淋巴细胞亚群（±s）比较

表2 两组外周血T淋巴细胞亚群（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05

数CD3+（%）CD4+（%）CD4+/CD8+比值移植组 治疗前 48 50.8±5.1 33.2±4.5 0.9±0.1移植3 m 48 61.7±7.4① 38.1±3.3① 1.4±0.1①6 m 48 67.9±6.5① 42.7±3.8① 1.5±0.2①对照组 治疗前 47 51.4±5.6 32.7±5.0 0.9±0.2移植3 m 47 55.3±7.2 34.2±3.1 1.3±0.1 6 m 47 60.3±5.5 38.2±3.5 1.4±0.1例

2.3 两组治疗前后肝硬度和Child-Pugh评分的比较 治疗前，两组肝硬度和Child-Turcotte-Pugh评分比较无显著性差异（P＞0.05）；治疗后，移植组肝硬度和Child-Pugh评分均显著低于对照组（P＜0.05，表3）。

表3 两组肝硬度和Child-Turcotte-Pugh评分（±s）比较

表3 两组肝硬度和Child-Turcotte-Pugh评分（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05

例数 肝硬度（kPa） Child-Pugh评分移植组 治疗前 48 9.6±0.3 9.6±1.9移植 3 m 48 8.3±0.2① 7.4±1.6①6 m 48 7.1±0.1① 5.5±1.5①对照组 治疗前 47 9.8±0.3 9.3±2.1移植3 m 47 8.7±0.2 8.3±2.3 6 m 47 7.9±0.1 7.4±2.3

2.4 两组血清细胞因子水平比较 治疗前，两组血清TNF-α、hs-CRP和IL-6水平比较无显著性差异（P＞0.05）；治疗后，移植组血清细胞因子水平均显著低于对照组（P＜0.05，表4）。

表4 两组血清细胞因子水平（±s）比较

表4 两组血清细胞因子水平（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05

IL-6（pg/mL）移植组 治疗前 48 48.5±11.4 12.3±3.5 37.5±3.5移植3 m 48 36.5±9.6① 9.8±2.9 24.5±4.3①6 m 48 28.0±8.7① 6.0±2.2① 18.9±5.6①对照组 治疗前 47 46.9±12.8 11.8±4.2 35.6±4.0移植3 m 47 41.5±9.8 10.3±4.0 30.9±6.3 6 m 47 36.2±8.6 8.7±3.5 25.2±7.9例数TNF-α（pg/mL）hs-CRP（mg/L）

3 讨论

由乙型肝炎病毒感染而发展的终末期肝病往往都存在严重的肝硬化，可导致患者消化道出血、门静脉高压、自发性细菌性腹膜炎和肝性脑病等严重并发症而危及生命[9，10]。相关研究指出，乙型肝炎病毒感染可造成肝脏损害，免疫应答反应失衡导致机体炎性反应，这些因素共同作用的结果是导致疾病进入终末期[11，12]。乙型肝炎病毒侵袭机体时会产生大量的炎性因子或代谢产物，同时激活人体免疫应答反应，在清除病毒的同时引起肝脏损伤[13，14]。在乙型肝炎病毒感染引起慢性肝炎的发病过程中，往往伴有TNF-α、hs-CRP和IL-6等细胞因子的参与。机体在清除乙型肝炎病毒的过程中，T淋巴细胞亚群具有重要的作用。所以，检测相关炎性因子和外周血T淋巴细胞亚群对于治疗乙型肝炎肝硬化患者具有重要的临床意义[15，16]。应用恩替卡韦和阿德福韦酯等抗病毒治疗，只能移植病毒复制，对于已经存在的肝硬化往往不能奏效。自体干细胞移植是近年来兴起的一种新兴技术。干细胞经体外培养、基因修饰和诱导，再回输体内，可能归巢至病变部位并发育成肝样细胞而发挥生理作用。这种方法已经广泛试用于对肝炎肝硬化患者的治疗[17，18]。

本研究在应用恩替卡韦和基础治疗改善患者一般情况的基础上，对部分患者再进行自体PBSC经肝动脉移植治疗，结果显示，在治疗后3个月和6个月时，患者血清胆红素水平显著降低，而血清白蛋白水平明显升高，表明自体干细胞移植可能通过合成多种细胞因子，促进了受损肝细胞的修复，肝功能得到显著改善。经自体PBSC移植术治疗的患者肝硬度值和Child-Pugh评分显著降低，说明自体PBSC移植术能改善肝脏的储备功能，控制肝硬化的进展速度，提高肝硬化患者的生存质量。此外，患者肝功能在得到明显改善后，食欲下降、乏力、腹胀和腹水等症状都有了明显的改善，显示出使用自体外周血干细胞移植在改善肝功能和临床症状方面更具有优势，其安全性也高。

本研究还显示，在使用自体PBSC移植术后3个月和6个月，患者外周血CD3+、CD4+细胞百分比和CD4+/CD8+细胞比值均有所提高，表明干细胞移植可以改善患者外周血T淋巴细胞亚群的紊乱。外周血CD4+细胞不能有效抑制自身免疫反应，将导致免疫性肝损害加重，可能是由于T淋巴细胞亚群失衡可产生大量的炎性因子，继而加重肝细胞受损，而自体PBSC移植术治疗是一种把健康的干细胞移植到患者体内，从而达到修复之前受损的肝细胞，促进外周血T淋巴细胞亚群紊乱的改善。本研究结果还显示，自体PBSC移植后的患者血清TNF-α、hs-CRP和IL-6水平降低更明显，考虑与自体干细胞移植能有效调节T淋巴细胞亚群紊乱，增强了细胞免疫力，继而有效降低机体的炎症反应，而在积极改善患者局部微环境后，也可减轻肝细胞的进一步损伤，这也可能是应用该方法治疗的患者疗效更显著的内在机制之一[19，20]。当然，干细胞移植治疗的复杂机制还需要深入研究。