自体骨髓干细胞移植治疗慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者疗效初步研究

闫焕杰，张淑芹，赵文静

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是在慢性肝病基础上出现的急性肝功能失代偿，病情进展迅速，病死率高达63%～72.3%[1-3]。在中国，乙型肝炎是导致ACLF的最常见病因[4]。目前，对于ACLF的治疗尚缺乏有效手段，血浆透析滤过[5]和肝移植技术可挽救部分患者生命，但由于肝源供体紧缺、术后并发症、免疫排斥等问题限制了肝移植的应用[6]。近年来，以干细胞为基础的细胞治疗应用于临床各领域，包括肝硬化和肝衰竭等，结果显示其疗效和安全性均较好[7-11]。本研究采用血浆透析滤过联合自体骨髓干细胞移植治疗早中期慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者，取得了一定的疗效，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 病例资料 2013年6月～2016年6月在我院住院的早中期ACLF患者120例，男96例，女24例；平均年龄（48.3±9.7）岁。诊断符合肝衰竭诊治指南（2012年版）的标准[12]，病因均为乙型肝炎病毒感染。排除标准：年龄＜8岁或＞65岁、孕妇或哺乳期女性、合并腹腔、肺部或其他系统严重感染、存在心、肺、肾等重要脏器功能不全/衰竭、存在恶性肿瘤或血液系统疾病、骨髓疾患或增生不良、并发肝性脑病、上消化道大出血、肝肾综合征、伴有Ⅲ期高血压、有HIV重叠感染、有酗酒或吸毒史、凝血酶原活动度＜35%或有严重出血倾向、外周血WBC＜4.0×109/L，PLT＜50×109/L或过敏体质等影响治疗者。本研究经医院医学伦理委员会审查批准，并报请上级卫生主管部门备案。

1.2 基本治疗 所有患者均接受标准内科综合治疗，包括抗感染、护肝、退黄、输注血浆、白蛋白、抗病毒治疗。给予血浆透析滤过（plasma diafiltration，PDF）治疗，使用日本旭化成IQ-21型多功能血液净化装置、EC-40血浆分离器和CHDF-21一次性血液管路，治疗用血浆1600～2000 mL，治疗时间为5.0～6.5 h，血浆分离速度为8～9 mL/min，血流量为100～120 mL/min，滤过液流量为50 mL/min，滤过液总量为15000～18200 mL。综合评估患者临床症状、血生化指标和凝血功能，确定PDF治疗次数，每周进行1～2次。

1.3 自体骨髓干细胞移植 术前，经治医生认真分析病情，向患者及其家属说明治疗可能引发的风险和并发症，签署《自体骨髓干细胞采集术知情同意书》和《干细胞移植知情同意书》。给予粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）100 μg皮下注射×2 d。在手术室行骨髓采集术，自髂后上棘抽取患者骨髓血150～200毫升，采用负收集法分离骨髓血单个核细胞（宁夏中联达生物有限公司），每例患者分离细胞数为 1.2×107～9.6×108，用0.9%生理盐水制成细胞悬液5 mL，在X光透视下经股动脉插管至肝固有动脉，将细胞悬液缓慢注入，术毕拔管，穿刺点加压包扎，绷带固定。

1.4 观察指标 使用日本光电肝功能储备分析系统（DDG-3300K）脉动色素密度法检测吲哚菁绿15分钟存留率（indocyanine green retention rate at 15 min，ICGR15）；使用奥林巴斯全自动生化分析仪（AU-2700）检测肝功能指标（宁波瑞源生物科技有限公司）；使用贝克曼血凝仪（ACL TOP7000）检测凝血功能指标（美国Instrument Laboratory Company）。应用美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）制定的活动状态评分表评价患者健康状况，ECOG评分是从患者的体力来了解其一般健康状况和对治疗耐受能力的指标。ECOG体力状况评分标准记分为0分：活动能力完全正常，与起病前活动能力无任何差异；1分：能自由走动及从事轻体力活动，包括一般家务或办公室工作，但不能进行较重的体力活动；2分：能自由走动及生活自理，但已丧失工作能力，日间不少于一半时间可以起床活动；3分：生活仅能部分自理，日间一半以上时间卧床或坐轮椅；4分：卧床不起，生活不能自理；5分：死亡。

1.5 统计学分析 应用SPSS 17.0软件行统计分析，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，率的比较采用卡方检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床症状的变化 血浆透析滤过治疗的62例患者接受111例次PDF治疗，平均治疗（1.79±0.92）次。治疗后患者乏力有不同程度的改善，精神好转，腹胀减轻。治疗12周，在40例并发腹水患者有9例（22.5%）腹水消退，5例（12.5%）腹水减少；治疗24周，32例生存患者8例（25%）腹水未完全消退；治疗48周20例生存患者无腹水；接受干细胞移植的58例患者共接受98例次PDF治疗，平均（1.69±0.72）次。在自体骨髓干细胞移植术后1周，患者食欲、体力改善明显，32例并发腹水患者在治疗12周24例（75%）腹水消退，4例腹水减少，在24周和48周，所有生存患者均无腹水。

2.2 两组肝功能指标变化的比较 见表1。

2.3 两组生存率比较 在治疗24 w和48 w，干细胞移植组患者生存率显著高于血浆透析滤过组（P＜0.05，表2）。在观察期间有68例患者死亡，其中血浆透析滤过组42例，干细胞移植组26例，其中52例死于多器官功能衰竭，其他死亡原因有严重感染、肝肾综合征和肝性脑病等。

2.4 两组患者体能状态评估和肝脏储备功能变化比较 在治疗24 w和48 w，干细胞移植组生存患者ECOG评分≥2级例数明显低于血浆透析滤过组（P＜0.05）；在治疗12 w和24 w，干细胞移植组ICGR15较治疗前明显好转，差异有统计学意义（P＜0.05），而血浆透析滤过治疗组治疗前后ICGR15无明显改善（表3）。

表1 两组肝功能指标（±s）变化的比较

表1 两组肝功能指标（±s）变化的比较

与正常组比，①P＜0.001；②P＜0.01

例数 TBIL（μmol/L） ALB(g/L) INR MELD血浆透析滤过 治疗前 62 357.3±114.6 28.7±4.9 2.1±0.4 23.2±5.6治疗 24 w 32 41.6±7.8 32.8±3.5 1.4±0.3 20.4±5.2干细胞移植 治疗前 58 376.2±104.4 28.3±5.1 2.0±0.3 24.8±5.9治疗24 w 41 43.9±6.7 35.0±3.7① 1.2±0.4① 18.6±4.1①

表2 两组生存率（%）比较

表3 两组ECOG评分≥2级病例数（%）和ICGR15(±s)比较

表3 两组ECOG评分≥2级病例数（%）和ICGR15(±s)比较

与血浆透析滤过组比，①P＜0.05

ICGR15治疗前 24 w 48 w 治疗前 12 w 24 w血浆透析滤过 24（75.0） 18（56.3） 8（40.0） 31.6±19.6 30.6±12.4 28.7±10.3干细胞移植 29（72.5） 11（27.5）① 4（12.5）① 32.2±18.6 29.46±7.16 20.6±8.1①ECOG评分≥2级

2.5 两组终末期肝病模型（model for end-stage liver disease,MELD）评分和 Child-Turcotte-Pugh（CTP）评分变化的比较 在干细胞移植后24 w，生存40例。12例治疗前MELD＜20分者MEDL评分下降，28例20≤MELD＜30分者，19例MELD＜小于20，另9例患者MELD评分有所下降。在移植后48 w，生存32例，其中MELD＜20分者20例，20≤MELD＜30分者12例；在治疗24 w，生存患者治疗前C级18例，B级22例，治疗24 w则变为A级24例，B级16例。在48 w生存者中，A级27例，B级5例；而在血浆透析滤过组，治疗24 w和48 w生存患者MELD和CTP评分变化不明显。

2.6 不良反应情况 在血浆透析滤过治疗过程中患者耐受性良好，无1例发生严重不良反应；干细胞移植成功率为100%，无1例患者发热、感染、白细胞下降，穿刺部位无出血或渗出。自体骨髓干细胞移植术后24 w所有患者经影像学检查，肝内未发现新生物或肿瘤样异常病灶。

3 讨论

干细胞是一类既有自我复制和高度增殖能力，又有多向分化潜能的细胞。研究表明，骨髓干细胞在肝脏微环境下可以分化为有功能的肝细胞，同时释放多种细胞因子参与肝脏的修复[14-16]。国内外学者研究表明，应用集落刺激因子动员骨髓安全有效，动员后的骨髓干细胞能更好地达到治疗目的，终末期肝病患者可耐受骨髓干细胞治疗，且对肝脏功能的修复有积极的促进作用[17，18]。Bai et al[19]采用自体骨髓干细胞移植治疗32例失代偿肝硬化患者，随访结果显示干细胞移植术后大多数患者血清白蛋白升高，胆红素下降，凝血功能改善，纳差、乏力等症状消失，腹水消退。陈阳述[20]等采用自体骨髓干细胞移植治疗33例失代偿期乙型肝炎肝硬化患者，结果显示在常规口服核苷类抗病毒药物和对症支持治疗的基础上，联合自体骨髓干细胞移植治疗失代偿期乙型肝炎肝硬化患者，能有效地改善肝功能，且手术相对安全，风险较低。有人采用自体骨髓干细胞移植治疗56例终末期肝病患者，数据分析结果显示干细胞移植后4周多数患者食欲和体力改善明显，纳差、乏力等症状消失、腹水消退，术后8周血清白蛋白升高、凝血功能改善，术后12周肝脏储备功能较治疗前明显好转。

本研究在前期工作基础上，采用血浆透析滤过联合自体干细胞移植治疗ACLF早中期患者，首先采用血浆透析滤过对患者进行支持治疗，改善机体内环境，使患者过渡到接受干细胞移植治疗，使干细胞更好地向受损肝脏归巢，发挥增殖和免疫修复作用。结果显示，ACLF患者经血浆透析滤过治疗后可以安全地接受自体骨髓干细胞移植治疗，接受干细胞移植的患者临床症状改善和腹水消退情况均优于血浆透析滤过治疗组。在治疗24 w和48 w，干细胞移植组患者生存率分别为70.7%和55.2%，明显高于血浆透析滤过治疗组。生存患者ECOG评分、MELD评分和CTP分级均优于血浆透析滤过治疗组，干细胞移植组术后8周血清ALB升高，术后12 w和24 w血清白蛋白升高最明显，血清CHE升高，PT缩短，肝功能在移植术后持续改善，在移植术后12 w和24 w时较术前肝功能改善最明显。术后12 w和24 w,干细胞移植组患者CGR15较治疗前明显好转。血浆透析滤过治疗组患者治疗前后各项指标发生部分改善，而干细胞移植组各项指标改善更明显。

综上所述，血浆透析滤过联合自体骨髓干细胞移植治疗乙型肝炎导致的ACLF早中期患者，可以有效修复肝损伤、改善肝功能、凝血功能和肝脏储备功能，提高患者的生存质量，延长患者生存期，本研究结果提示该方法为乙型肝炎相关性ACLF患者提供了新的治疗手段。我们的研究仍处在起步阶段，如何在完全意义上促进移植的干细胞向肝细胞转化，以便更有效地改善病变肝组织的结构和功能仍是今后研究的重点。