改良QuEChERS法结合UPLC-QTRAP-MS/MS技术测定玉米中的伏马毒素B1、B2

孟繁磊，宋志峰，王巍巍，杨 建，魏春雁

(吉林省农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所, 长春 130033)

伏马毒素(Fumonisin，FB)是由串珠镰刀菌(FusariummoniliformeSheld)产生的水溶性代谢产物[1]。1988年，Gelderblon等[2]首次从串珠镰刀菌培养液中分离出伏马毒素。随后，Laurent等又从伏马毒素中分离出伏马毒素B1(FB1)和伏马毒素B2(FB2)。到目前为止，发现的伏马毒素中FB1是其主要组分。有报道指出，伏马菌素对人、畜不仅是一种促癌物，而且完全是一种致癌物，可以损害肝肾功能，引起马脑白质软化症和猪肺水肿[3-4]。FB1对食品污染的情况在世界范围内普遍存在，主要污染玉米及玉米制品[5]。由于玉米是我国最重要的粮食作物之一， 主要用于人类和动物的直接食用。因此，建立可靠、简便、灵敏、高效的玉米中伏马毒素的检测方法，可为我国食品安全提供必要的技术支撑，对保护人们的身体健康也具有重要意义。

目前，已经报道了多种测定伏马毒素的方法，主要有薄层色谱法[6]、酶联免疫法[7]、高效液相色谱法[8-9]、液相色谱-质谱联用法[10-15]等。近年来，伏马毒素的检测方法主要是采用免疫亲和柱(IAC)、固相萃取柱(SPE)、多功能净化柱等净化方法，结合液相色谱和液相色谱串联质谱法等。但这些方法都有一些缺点，如非同步提取、多个步骤和可能的交叉反应等，且所需的材料成本都很高。QuEChERS方法最早应用于水果、蔬菜中农药残留的检测，具有快速、简单、廉价、有效、坚固和安全的特点，适用于批量样品的快速检测。本研究改进QuEChERS样品制备方法，使样品的前处理过程简单快速，并适用于玉米中伏马毒素的提取净化，同时结合UPLC-QTRAP-MS/MS技术，采用多反应检测(MRM)-信息依赖采集(IDA)-增强子离子扫描(EPI)模式检测，可更加准确地进行阳性判别。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

2017年秋季从吉林省各市县收集玉米样品50份。将研磨和彻底均质的样品转移到气密塑料袋中，密封，并在室温下储存在干燥器中，待测。

乙腈、甲醇、甲酸：色谱级；无水硫酸镁、氯化钠：分析纯；PSA、C18：美国安捷伦公司；中性氧化铝；伏马毒素B1(50 μg/mL)、伏马毒素B2(50 μg/mL)标准品：奥地利Biopμre公司；石墨化碳黑。

1.1.2 仪器与设备

AB QTRAP 5500质谱仪：美国AB Sciex；Shimadzu LC-30A超高效液相色谱仪：日本岛津公司；RM 2255涡旋混匀器：德国IKA公司；SC-3610离心机；NR-3空气浴振荡器。

1.2 实验方法

1.2.1 样品改良QuEChERS法前处理

1.2.1.1 提取

准确称取2.5 g(精确至0.001 g)玉米粉于50 mL刻度离心管中，对于加标样品，加入所需体积的标准溶液；加入10 mL提取液(乙腈-水-甲酸，体积比50∶40∶10)，旋涡混匀30 s，振荡1.5 h，然后加入无水硫酸镁和氯化钠各3.0 g，剧烈振摇1 min；5 000 r/min离心5 min，取上层清液待净化。

1.2.1.2 净化

取2.0 mL待净化液转移到含有无水MgSO4(0.3 g)+ C18(0.05 g)+ 中性氧化铝(0.05 g)+ PSA(0.1 g)+石墨化碳黑(0.10 g)的离心管内，旋涡混匀30 s，以5 000 r/min离心5 min，取上层0.5 mL过0.22 μm微孔滤膜于进样瓶中，加入0.5 mL水，混合均匀后UPLC-QTRAP-MS/MS待测。

1.2.2 标准溶液配制

分别移取100 μL的伏马毒素B1、B2标准溶液于5 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，配成质量浓度均为1 μg/mL的储备液，于-20℃保存。取空白玉米样品，按照1.2.1制备样品，得空白样品提取液，用空白提取液配制伏马毒素B1、B2质量浓度均为10、20、50、100、500 μg/L的基质标准混合溶液，现用现配。

1.2.3 UPLC-MS/MS条件

1.2.3.1 色谱条件

色谱柱：Kinetex SB-C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：A相为0.1%甲酸溶液，B相为甲醇，梯度洗脱程序为0～10 min，20%～95%B；10～15 min，95%～95%B；15.1～20 min，20%B；柱温：40℃；进样量：3 μL。

1.2.3.2 质谱条件

电离模式：电喷雾正离子扫描；离子化电压5.5 kV；气帘气241 kPa；雾化温度550℃；雾化气379 kPa；辅助气414 kPa。其他质谱采集参数见表1。

监测方式：MRM-IDA-EPI；IDA参数：1 000 CPS触发启动，采用动态背景扣除模式；EPI参数：扫描速度10 000 Da/s，扫描范围(m/z)50～900 Da；EPI碰撞能量：20、35 eV。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 MS/MS条件的优化

将伏马毒素B1、B2配成100 μg/L的单标，通过针泵直接进样，优化确定[M+H]+作为母离子，然后优化DP电压，最后采用子离子扫描选择2个响应值最强的子离子，建立MRM离子对通道，优化碰撞电压(CE)。伏马毒素B1、B2监测离子对、DP电压、碰撞电压见表1。

表1 伏马毒素B1、B2监测离子对、DP电压和碰撞电压

2.1.2 色谱条件的选择

伏马毒素B1、B2均在正离子模式下有较高响应，所在水相中加入一定比例的酸可以促进电离，所以选用较为常用的0.1%甲酸溶液作为流动相。通过比较色谱分析方法中常用的甲醇和乙腈分别作为有机相时对色谱分离的影响，发现甲醇作为有机相时，化合物的响应值较高。因此综合考虑，选择使用0.1%甲酸溶液-甲醇作为流动相体系。在此条件下伏马毒素B1、B2可得到较好地分离(见图1)。

图1伏马毒素B1、B2的色谱图

2.2 定性方法的确认

液相色谱-串联质谱法在测定过程中，一般常常认为离子对“出峰”即为检出，即为阳性结果，但在实际检测过程中由于基质的复杂和干扰较大，经常会出现假阳性现象，进而影响筛查结果的正确性和筛查报告的严谨性。本研究利用超高液相色谱-三重四级杆复合线性离子阱质谱(UPLC-QTRAP-MS/MS)技术，采用MRM-IDA-EPI检测模式，使伏马毒素在出峰时，一旦响应超过预设的数值，便自动触发增强子离子扫描模式(EPI)，能够得到更低浓度化合物的二级质谱图，该谱图与标准品的谱图比对，可进行更准确的阳性判别。

2.3 方法学验证

2.3.1 方法的线性关系、检出限、定量限

取1.2.2空白玉米样品基质液配制的标准系列工作液，按照1.2.3的条件进行测定，以伏马毒素B1、B2的质量浓度(x)为横坐标，定量离子的峰面积(y)为纵坐标绘制工作曲线，检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别以信噪比的3倍和10倍计算，结果见表2。

表2 FB1、FB2线性方程、检出限、定量限

2.3.2 方法的回收率与精密度

取空白玉米基质，选择低(LOQ)、中(2×LOQ)、高(5×LOQ)3个不同添加水平，每个水平平行测定6次，计算平均值、回收率，同时计算相对标准偏差(RSD)，结果见表3。由表3可知，伏马毒素平均回收率在89.11%～104.61%之间，RSD为2.33%～9.89%，方法显示了较好的回收率与精密度，符合GB/T 27404—2008实验室质量控制规范。

表3 回收率与精密度结果

2.4 方法比较

取玉米空白样品12份，制成20 μg/kg加标阳性样品，分别按照本方法和GB 5009.240—2016《食品安全国家标准 食品中伏马毒素的测定》中的液相色谱-串联质谱法(免疫亲和柱净化)进行测定，结果见表4。

表4 方法比较结果(n=6)

由表4可知，利用2种方法检测玉米粉中的2种伏马毒素，在对检测结果进行t检验(α为0.05)时，2种方法无显著性差异，证明本方法准确可靠，实际可行。但是本方法检测时间短、检测成本低。

2.5 方法应用

利用本实验建立的方法，对吉林省内采集的50份玉米样品中伏马毒素B1、B2进行了检测，结果表明，玉米样品受伏马毒素的污染较为严重，42个样品检出伏马毒素B1，污染水平范围151.12～805.6 μg/kg，低于欧盟规定的直接供人类消费的玉米及其制品的限量标准(1 000 μg/kg)。

3 结 论

采用改良QuEChERS样品制备方法，将样品与酸化的乙腈水溶液混合振荡提取，然后使用MgSO4、NaCl进行盐析液体分配，通过用MgSO4、PSA、C18、石墨化碳黑和中性氧化铝分散固相萃取净化，C18色谱柱分离，以甲醇-0.1%甲酸溶液为流动相梯度洗脱，正模式扫描，采用多反应检测(MRM)-信息依赖采集(IDA)-增强子离子扫描(EPI)模式检测，在线EPI谱库定性分析，外标法定量。与国标方法相比，检测结果无显著性差异，但本方法操作简便快速，检测时间缩短，检测成本降低，可为玉米中伏马毒素含量的测定提供检测依据，也可为其他基质中伏马毒素的评估提供技术支撑。