非洲猪瘟的样品采集

文│中国动物疫病预防控制中心

非洲猪瘟（ASF）的任何实验室检测都始于样品采集。样品采集过程中重要的考虑因素是调查的目的，例如诊断、监测或无疫认证。对哪些动物采样将取决于抽样的目的。例如，当调查疫情暴发（被动监测）时，应对针对患病和死亡动物，而在检查动物是否暴露于病原（主动监测）时，应对年龄最大的动物进行抽样。

负责抽样（并进行临床检查）的人员在开展相关操作前应该接受过保定猪的技术培训（包括临床检查和取样）。

采样小组应根据采样动物的数量准备充足的采样设备。

这些实用指南是针对现场和实验室团队制定的（译者：具体操作应首先符合我国相关规定）。

一、采样所需材料

一般材料：标签和永久的记号笔；数据记录表、笔、写字板；盛放针和刀片的利器盒；高压灭菌处理袋。

个人保护设备（PPE要求将有所不同，例如监测与暴发调查）：专用服装（防护服）；橡胶靴；鞋套；手套；面罩；护目镜；洗手的消毒剂；清洗靴子的消毒剂。

样品运输的材料：基本的容器/管/小瓶（防漏并标示清楚）；吸水材料；能够耐受95KPa的，最好是塑料材质的容器或袋子，作为密封性的2次包装（即防漏）、用于储存每只动物样品的容器和采血管；冷藏箱（4℃），汽车电池驱动为优选，例如，填充有冷却材料的聚苯乙烯泡沫塑料盒（例如冰、冷冻水瓶或适当的冷包装，如能使所需温保持长达数天的具有特殊冷凝胶的一些商品化冰袋）；便携式-80℃冷冻箱/干冰/液氮罐（仅在距离设备齐全的实验室进行取样时才需要）。在运输样品时，必须要始终保持上述“三重”安全结构的包装。

活体动物采样的材料：保定动物的材料（如套索、木板）；清洁采样处所需的消毒剂和脱脂棉；采血用的不含抗凝剂的无菌采血管（10毫升）（红色盖子）；采集抗凝血的含有EDTA的无菌采血管（10毫升）（紫色盖子）；根据猪的大小和采样部位（颈静脉、耳缘静脉）选取真空采血管或10～20毫升真空针头注射器；滤纸/干血斑（DBS）卡。

尸体采样所需的材料：样品架或冻存盒；用于收集病料的无菌2毫升冻存管（如果无法满足冷链运输，可以提前加入RNA保护剂，以便于样品的保存）；刀、磨刀器、剪切机、带刀片的手术刀、钳子和剪刀；盛有消毒剂用于对刀、剪刀进行消毒的容器，从而避免不同脏器和不同动物个体之间的交叉污染；可密封的塑料容器，装满10%中性福尔马林缓冲液（动物脏器体积∶福尔马林体积比为1∶10）；处置动物尸体所需的适当材料。并包含可能由于其他原因（例如，失效的真空采血管）而丢失或不可用的材料数量。另外，数据收集、个人防护/生物安全和样品运输的物品必须包装。

建议准备一份现场采样表格，以便将现场收集所有样品和相关信息统计到一起。如果预期将样品提交给区域/国际参考实验室，建议一式两份取样，以便对提交的样品进行留样，避免在反复冻融或分割样品。

取样应小心谨慎，并按照适当的方法避免对动物造成过度的应激或伤害，或对采样人员造成伤害。应无菌收集并注意避免交叉污染，并始终使用新的针头以避免疫病传播。所有等待检测的样品都应该被认为有感染性并应进行相应处理。养殖场使用的所有采样材料应按照当地法规进行安全处理，例如，装袋并运送回实验室进行高压灭菌或适当处置。

提交到诊断实验室的相关样品应有清晰且保存持久的标签，样品质量良好。

二、样品类型

1.全血。使用含有抗凝血剂（EDTA-紫色盖）的无菌管（真空采血管）从颈静脉、下腔静脉或耳静脉抽取全血。如果动物已经死亡，可以从心脏中采血，但必须立即进行。避免使用肝素（绿色盖子），因为其可以抑制PCR反应（造成假阴性）或由于红细胞吸附试验（HAD）造成假阳性的产生。血液是PCR检测和病毒分离的目标样品。通过离心分离出的血浆可以用间接免疫过氧化物酶试验（IPT）或间接荧光抗体（IFA）试验进行抗体的检测。

通过干血斑（DBS）进行微量体积血液样品的采集和储存，以便进一步进行DNA和（或）抗体检测。这些卡片在偏远地区或者在无法冷链运输的时候很有帮助，比如在热带地区的狩猎环境和农村地区。然而，使用干血斑（DBS）进行非洲猪瘟检测时，基因组和（或）抗体检测测试的灵敏度低于全血或血清样品。通过将几滴由刺血针或无菌注射器针头从动物的静脉或皮肤滴加到特制的吸水滤纸中完成干血斑（DBS）样品的收集。血液样品应该完全浸透在滤纸，并风干数小时。将样品储存在低透气性的塑料袋中，加入干燥剂以减少湿度，即使在热带气候下也可以保持在环境温度中。

2.血清。使用未加抗凝剂（红色盖子）的真空采血管从颈静脉、下腔静脉、耳缘静脉，或剖检过程收集血液样品。返回实验室后，血液样品应在4±3℃下放置14～18小时以分离血凝块（译者：此处与我国实际操作不同，仅供参考）。弃去凝固物，并离心10～15分钟后，回收澄清的上清液（血清）。如果血清是红色，这表明样品发生了溶血，可以在酶联免疫吸附试验（ELISA）中产生假阳性反应。通常已经死亡动物的血液样品易发生溶血（例如野猪）。血清样品在分离后可以立即开展抗体和病毒检测，或者在-70℃以下储存备用。对于抗体检测，储存在-20℃已足够，但是对于病毒检测，最好存于更低温度。

3.器官和组织样品。虽然所有的猪器官和组织都可以用来检查ASFV的存在（主要是该病的急性和亚急性的形式），但目标器官是脾脏、淋巴结、肝脏、扁桃体、心脏、肺和肾脏。其中，脾脏和淋巴结是最重要的，因为通常它们的病毒含量是最高的。骨髓也可用于死亡野生动物病例，因为如果动物已经死了一段时间，则骨髓可能是唯一相对保存完好的组织。可以通过关节内组织液以检查低毒力毒株的存在。建议将样品保持在4℃，尽快（48小时内）提交给实验室。如果由于物流原因无法保障的，样品可以储存在冷库或液氮中。对于组织病理学研究，也可以同时提交用10%缓冲福尔马林浸泡的样品。虽然这些样品不能用于进一步的病毒分离研究，但可用于PCR反应和免疫组织化学试验。

通过PCR反应、病毒分离和（或）抗原检测ELISA的方法进行病毒检测时，需要将样品用磷酸盐缓冲液制备成10%（w/v）的均质组织悬液。在离心后，建议对上层清液进行过滤，并用0.1%的抗生素在4±3℃处理1小时。经过匀浆处理组织可以立即用于ASFV病毒和（或）核酸的检测，或存储在-70℃以下备用。对于PCR反应，建议对10倍稀释样品或上清进行检测的同时，对未稀释样品也进行检测。从脾脏、肝脏和肺等脏器中提取的渗出物对于使用免疫过氧化物酶试验（IPT）和间接荧光抗体试验（IFA）方法检测抗体非常有用（Gallardo，2015）。

4.软蜱样品。钝缘蜱属软蜱可以用于检测ASFV和病毒基因组。可从疣猪的洞穴、裂缝、洞穴中收集蜱虫，有时也可以从猪圈内的啮齿类动物的洞穴中收集。不同种类的蜱会有不同偏好的场所和栖息地。有三种收集技术：手动收集、二氧化碳诱捕和真空吸引捕捉。收集后，应让蜱保持存活或直接储存在液氮中，以确保蜱内病毒的保存完好，并避免DNA降解。

目标样品的最小需求量。对于使用酶联免疫吸附试验（ELISA）的抗体检测以及验证性试验，建议的最小剂量为：血清500微升。对于使用PCR反应和病毒分离的方法检测非洲猪瘟（ASF）病毒时：血清1毫升；血液（EDTA-血液）1毫升；没有福尔马林的器官（推荐的最低量）5克。（注：本文节选自《联合国粮食及农业组织（FAO）动物生产及卫生手册》）