美国国家家禽改良计划标准程序（2014版）—血液检测程序（1）

2019-01-22译校张淼洁张倩翟新验中国动物疫病预防控制中心

中国畜牧业 2019年1期

译校│张淼洁张倩翟新验（中国动物疫病预防控制中心）

译者按：美国国家家禽改良计划（National Poultry Improvement Plan, NPIP）于20世纪30年代初建立，是一个由行业、各州和联邦共同合作计划。通过该计划，新的诊断技术可以有效地应用于改善美国的家禽和家禽产品。NPIP最初的目标是净化美国鸡群中由鸡白痢沙门氏菌引起的鸡白痢。该计划后来不断进行扩充和改进，包括了预防和控制家禽疾病的各种方案，涵盖了伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸡毒支原体、滑液支原体、支原体和禽流感。NPIP目前还包括商业家禽、火鸡、水禽、展览家禽、散养家禽和野禽。该计划的参与者都是自愿的，但种鸡场、孵化场和经销商必须首先取得“鸡白痢鸡伤寒无疫”资格才能参加其他计划。NPIP的技术和管理规定由行业成员和州、联邦官员共同制定，建立了家禽在NPIP所列疾病方面无疫的评估标准，要求对满足该计划特定疾病控制标准的州、养殖场、孵化场、经销商和屠宰场进行确认，并对禽群进行检测。《国家家禽改良计划标准程序》是NPIP实施中重要的程序文件，我们对其公开发布的2014版进行了翻译和整理，包括血液检测程序、细菌学检查程序、卫生程序和分子检查程序四个部分，供读者借鉴。

1 标准试管凝集试验

（a）应按照如下方式采集和运输血样。

（1）血液样本应由合格的授权

人员用实验室提供的专用容器进行采集。容器最好为3/8×3英寸（1英寸=2.54厘米）的无边粗体试管，或小型精选药瓶。这些试管或药瓶必须经过彻底清洁，并在热风干燥炉中烘干。如果用到瓶塞的话，应将瓶塞进行彻底清洁和干燥。

（2）用小而锋利的手术刀在鸡翅静脉上切一道口子，使血液流入试管中，或直接用小型注射器抽血（用20或21号针头）。在两次取血之间，必须用生理盐溶液妥善清洗注射器。为了便于分离血清，应将试管倾斜放置，直到血液凝固为止。当血液完全凝结后，应将它们打包并通过邮寄等方式送往实验室。所有标签必须清晰且持久，可以用合适的铅笔在试管有刻度的一侧进行标记，也可以用带有黏性的标签。

（3）血液样本必须在新鲜未溶血的状态下到达实验室。不应接收溶血的样本。因此，在倾斜放置试管和血液凝结后，需立即冷却试管。若样本不能在几小时内到达实验室，则将样本包装在加冰的专用容器中，或使用一些其他冷链系统，以确保样本在运输途中的保存。在极端寒冷的季节，必须采取极端的预防措施以防止冻结和红细胞溶解。样本到达实验室后，必须立即置于冷藏（5～10℃）储存状态中。

（b）抗原应由具有已知抗原成分、高凝集性且对阴性和非特异性血清不敏感的鸡白痢沙门氏菌代表株组成。为维持菌株的活力，每个月至少将原菌培养物转移到新的斜面琼脂一次，且置于温度为18～25℃（平均室温）的黑色柜子或箱子中保存，随后在37℃的环境下孵育24～36小时。此外，应持续检查原菌培养物的抗原性成分和纯度。

（c）满足培养的培养基应包含下列成分（见表1）。

表1 培养的培养基成分

（d）在用大的1英寸试管、科勒烧瓶或布莱克培养瓶盛装的整个琼脂表面，用从所选菌株的原种培养物配制而成的48小时斜面琼脂培养基上培养的接种物进行划线扩增培养。抗原培养的试管或培养瓶应放在37℃的环境中孵育48小时，用含有0.5%苯酚的0.85%盐水溶液洗掉表面的培养物，形成重悬浮液。借助吸力的作用，使悬浮液通过布氏漏斗中的薄层脱脂棉，从而过滤掉细菌凝集块。分离菌株的抗原应以等体积密度组合，放置在密封瓶中于冰箱中（5～10℃）保存。

（e）硫代硫酸甘油（T G）培养基也可用作制备试管凝集反应抗原的替代培养基。以前，该种培养基用于制备染色的全血抗原。这种培养基提供了一种具有高度特异性的试管抗原，极大地提高了定量的培养基中抗原的产量。硫代硫酸甘油培养基包含以下成分（表2）。

表2 硫代硫酸甘油培养基成分

在用大的1英寸试管、科勒烧瓶或布莱克培养瓶盛装的整个琼脂表面，用从所选菌株的原种培养物配制而成的24小时牛肉浸粉培养基上培养的接种物均匀接种涂开。抗原培养的试管或培养瓶应放在37℃的环境中孵育96小时，用含有0.5%苯酚的0.85%盐水溶液洗掉表面培养，形成重悬浮液。借助吸力的作用，使悬浮液通过布氏漏斗中的薄层脱脂棉，从而过滤掉细菌凝集硬块。需对抗原进行离心处理。应该从离心管或碗中去掉细菌凝集硬块，并使其重新悬浮在含有0.5%苯酚的0.85%盐水溶液中。细菌凝集硬块在稀释液中均匀悬浮后，应再次在没有吸力的作用下，通过布氏漏斗中的棉垫进行过滤。分离菌株的抗原应以等体积密度组合，放置在密封瓶中于冰箱中（5～10℃）保存。

（f）用于常规检测的稀释抗原应该用抗原原液进行配制，即用含0.25%苯酚的0.85%生理盐水溶液将抗原原液稀释至麦氏比浊管上对应0.75～1.00的浓度。应通过加入稀释的氢氧化钠，将稀释抗原的氢离子浓度调整到pH8.2～8.5。每天都应配备新的稀释抗原，且保存在冷藏环境中。使用时，在4*1/2英寸的试管中加入2毫升稀释抗原，或在更小的试管中加入1毫升稀释抗原，用于制备和孵育最终的血清抗原混合溶液。可通过长滴管或特殊的充填器来完成试管中的抗原分装。

（g）鸡的最大血清稀释度不得超过1∶50，火鸡不得超过1∶25。现有数据表明，1∶25的稀释度最有效。在所有关于血液检测的官方报告中，都应列明血清稀释度。需用清洁干净的血清移液管或专用血清转移装置取适量的血清到凝集管中，避免混入其他血清。孵育前，应将抗原和血清充分混匀。混匀后，血清和抗原混合物必须在37℃的环境中至少孵育20小时。

（h）检测结果记录方式：当血清抗原混合物呈均匀浑浊状态时，记录N或-（阴性）；当出现明显的抗原结块，且凝集颗粒之间的液体呈清澈状态时，记录P或+（阳性）；当只有部分发生凝集反应，或凝集不彻底时，记录S或？（可疑）；当原始记录表中列举出的样本丢失时，记录M或遗失。当血液样本发生溶血，且无法进行检测时，记录H或发生溶血；当采样管破裂，无法获得血清时，记录B或破损。（必须始终考虑到不同抗原和不同装置灵敏度的差异，独立做出判断。同时，需要考虑到禽群的历史。当禽群中某些个体出现可疑的凝聚反应时，最好对有代表性的家禽进行细菌学检查，从而确定是否存在鸡白痢沙门氏菌）。

2 快速血清检测试验

（a）在快速血清检测中，血液样本的采集和运输程序与标准试管凝集试验所述标准相同。

（b）鸡白痢沙门氏菌合适菌株的选择和维持以及理想的培养基成分已经在1（b）和1（c）描述过了。

（c）用从所选菌株的原种培养基配制而成的48小时斜面琼脂培养基上培养的接种物，在大的1英寸试管、科勒烧瓶或布莱克培养瓶上进行划线培养。

（d）用试管或瓶子盛装的抗原需在37℃的环境中孵育48小时，且应以少量的含0.25%～0.5%苯酚的浓度为12%的氯化钠溶液进行洗涤，并通过松散放置在无菌漏斗顶部的消毒脱脂棉进行过滤。

（e）应使用含0.25%～0.5%苯酚的浓度为12%的氯化钠稀释洗涤液，使其浑浊度比麦氏比浊管中，0.75号麦氏管的浓度高出50倍或在盖茨浊度计上的读数为7毫米。

（f）针对单个菌株抗原，需要与已知合适的抗原进行比较，用阴性血清检测其不灵敏性，用阳性血清检测其高凝集性。分离菌株的抗原应以同等体积密度组合，放置在密封瓶中于冰箱中（5～10℃）保存。

（g）该检测试验应在合适的光滑平板上进行。与标准试管凝集试验相比，血清抗原的稀释度不得超过1∶50。在检测火鸡血液样本时，最好同试管凝集试验方法一样，血清抗原的稀释度为1∶25。将血清加入到抗原中时，应用血清移液管的尖端进行充分搅拌。大多数强阳性反应会在15～20秒钟内就会出现明显的结果，最终的结果应在2～3分钟后读取。在大约37℃的环境下加热平板可以加速凝集反应。在读取结果前，应转动平板数次。

（h）应按照1（h）中的规则记录检测结果。

3 染色抗原快速全血检测试验

（a）此处没有提到抗原的制备方法，因为该抗原是一种专利产品，只有在获得农业部许可的情况下才能生产该种产品。

（b）通常可以从抗原制造商那里获取一个用于测量正确血液量的闭环。理想的闭环是用一根21/2英寸长的20号测量用镍铬合金线制成，环的末端被塑造成直径达十六分之三英寸的小环。当该环中充满血液时，血液看上去会凸起，能够盛满0.02毫升的血液。用滴管头能调为盛装0.05毫升液体的医药用滴管来量取抗原。经证实，一个约15英寸平方的能够提供48个检测空间玻璃板，适合做这项试验。使用这样一个玻璃板能够使测试者能够同时观察一系列连续的试验混合物，而不用停止工作，等待结果，然后才开始检查下一只家禽。

（c）应在测试玻璃板上滴一滴抗原，应从翅静脉中取一个铂环量的血液。将闭环浸没在血液中，然后小心地取出，闭环就会被填满。俯视该充满血液的闭环边沿时，可以观察到血液似乎凸起。随后，应将该圈血和该滴抗原进行搅拌，混合液将扩散至直径约1英寸。随后，需用清水冲洗该闭环，如果必要的话，用一张干净的吸墨纸将其擦干。应从一侧到另一侧晃动检测板几次，使抗原和血液充分混合，并加速凝集。抗原的使用应遵照生产商的指示。

（d）与其他凝集检测一样，检测人员在本试验中会观察到不同程度的反应。血液的凝集能力越强，凝集速度越快，凝块面积越大。在阳性反应中，可以明显观察到抗原凝块，且周围可见清晰的间隙。这种反应在白色背景下很容易观察到。在稍微较弱的阳性反应中，可以观察到细小但仍清晰可见的抗原凝块，且周围的间隙只是部分清晰。在这种状态和阴性或同种类涂片中，有时候会出现一个肉眼几乎看不到的微小粒状物，诊断病情时应忽视这一点。在涂片变干前发生的极其细微的边缘凝集反应也被视为阴性。在阴性反应中，涂片中的液体依然保持均匀（应考虑到不同抗原和试验设备在灵敏度方面的差异，做出独立的判断）。此外，还需考虑到禽群的历史。当禽群中一些禽出现可疑的凝集现象时，需要选择有代表性的禽只进行细菌学检查，以判断其是否存在鸡白痢沙门氏菌感染。