复方蝮蛇毒胶囊抗凝血酶活性质量标准评价研究＊

吴 洋，闫 戈，张庆新，马晓昱，刘云云，迟 强，陈 瑶

心脑血管病是致残率和病死率都极高的疾病，抗凝血药物是抗血栓药物研制的热点。抗血栓中成药因作用全面温和，不良反应低受到人们的关注［1］。中成药质量标准多以药品中某个或某些成分的含量测定作为主要检测指标，但该方法在化学成分与药理作用评价相关性方面还存在一定的差距［2］，特别是复方或含有动物药成分的药品，很难以某一成分的含量作为评价药品质量和药理作用的标准。复方蝮蛇胶囊是解放军第406医院研制的纯中药制剂，由地龙、蝮蛇毒、丹参、川芎和当归等多种药材组成，具有益气行气、活血逐瘀的作用，临床用于治疗各种脑血栓中风后遗症之半身不遂、口眼歪斜、手足发麻、发凉等症，取得了良好的治疗效果。该制剂建立了薄层色谱鉴别和HPLC法定量测定阿魏酸含量的质量标准，然而阿魏酸含量的高低却很难反映与制剂活血化瘀疗效的关系。研究表明抗凝血酶活性与活血化瘀作用具有一定的相关性［3-5］，如何通过抗凝作用的定量评价提供药品抗血栓作用的强弱？该研究在前人研究的基础上，采用抗凝血酶活性为指标，对复方蝮蛇毒胶囊抗凝血作用的强度进行测定，为复方中成药质量标准和药理作用相关性提供依据。

1 仪器与试药

METTLER AE240电子天平；AS-B超声波清洗仪；洁净工作台；Thermo移液器；电热恒温水浴锅。凝血酶（批号223D063，1000U/支，索来宝生物科技有限公司）；牛纤维蛋白原（批号601B0210，索来宝生物科技有限公司）；复方蝮蛇毒胶囊样品（解放军第 406 医院，批号 141018、141019、141020）；氯化钠注射液（批号1701110722，辰欣药业股份有限公司），三羟甲基氨基甲烷（批号20180117，国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 抗凝血酶的含量测定［2，6，7］

2.1.1 供试品溶液的制备 取地龙粉末1.08 g，精密称定，精密加入0.9%氯化钠溶液5 ml，充分搅拌，浸提30 min，时时振摇，离心，4000 rpm/min离心15 min，上清液作为供试品溶液A；取蝮蛇毒末0.0144 g，同法配制供试品溶液B；取地龙粉末1.08 g和蝮蛇毒粉末0.0144 g，同法配制供试液C；取3个批号制剂样品，每个批号分别取18粒胶囊内容物约 7.2 g（含约地龙 1.08 g，蝮蛇毒 0.0144 g），精密称定，精密加入0.9%氯化钠溶液30 ml，同法配制供试品溶液 D1 （批号 141018），D2 （批号 141019）和D3（批号141020）；按照同等比例取无地龙和蝮蛇毒的中药材混合物6.1 g，精密称定，精密加入0.9%氯化钠溶液30 ml，同法配制供试品溶液E。上述供试液A，D和E分别稀释20倍，供试液B和C分别稀释120倍，作为最终相应供试品溶液。

2.1.2 阳性对照溶液的制备 取水蛭粉末1 g，精密称定，同法配制，作为水蛭阳性对照溶液。

2.1.3 阴性对照溶液的制备 以0.9%氯化钠溶液作为阴性对照溶液。

2.1.4 牛纤维蛋白原溶液的制备 精密取牛纤维蛋白原的凝固物适量，加三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，制成含量为0.5%的溶液（临用前配制）。

2.1.5 凝血酶溶液的制备 取凝血酶1000 U，加0.9%氯化钠溶液，制备成1000 U/ml的贮备液，再取适量加0.9%氯化钠溶液制备成40 U/ml的凝血酶溶液。

2.1.6 测定方法 精密量取供试品溶液100 μl，置试管（8 mm×38 mm）中，加入含 0.5%（牛）纤维蛋白原溶液 200 μl，摇匀，置水浴中（37±0.5） ℃温浸5 min，滴加每1 ml中含40单位的凝血酶溶液（每1 min滴加1次，每次1 μl，边滴加边轻轻摇匀）至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式计算，结果见表1。

表1 复方蝮蛇毒胶囊抗凝血酶活性比较

C1V1式中U——每1 g含凝血酶活性单位，U/g；C1——凝血酶溶液的浓度，μ/ml；C2——供试品溶液的浓度，g/ml；C2V2V1——消耗凝血酶溶液的体积，μl；V2——供试品溶液的加入量，μl；

该结果显示，蝮蛇毒为本制剂中抗凝血效果最强的药物，抗凝血作用>160000 U/g，其次为地龙抗凝血作用>300 U/g，植物药材混合物也具有一定的抗凝血活性，抗凝血活性接近200 U/g。制剂抗凝血酶活性平均值为333 U/g。

2.2 不同影响因素对抗凝血酶活性测定的影响

2.2.1 供试品浓度对抗凝血酶活性测定的影响分别取2.1项下未稀释的供试品溶液，稀释20倍的供试品溶液和稀释120倍的供试品溶液进行抗凝血酶活性测定。结果见表2。

实验先参照水蛭的抗凝血酶活性实验进行，水蛭可以形成稳定的凝固状态，而蝮蛇毒原液和蝮蛇毒+地龙样品无论怎样增加凝血酶的体积都无法形成稳定的凝固状态，相比较提取体积大的制剂则可以形成半凝固状态，进一步稀释后，中药材、制剂和地龙样品在稀释20倍后出现稳定的凝固状态，而蝮蛇毒单品和蝮蛇毒+地龙样品只能呈现半凝固状态，因此继续增加了稀释倍数，稀释至120倍后，呈现稳定的凝固状态。因此，该实验不同的样品最终采用了不同的稀释倍数。水蛭为原液，地龙、中药材和制剂样品选择稀释20倍，蝮蛇毒单品和蝮蛇毒+地龙样品采用稀释120倍。

表2 不同稀释倍数对供试品溶液抗凝血酶活性的影响

2.2.2 凝血酶浓度对抗凝血酶活性测定的影响凝血酶为逐次滴加，不同浓度凝血酶在滴加后形成的凝胶状态不尽相同，浓度为40 U/ml时凝固速度为2～4 min，浓度为20 U/ml凝固速度变慢，当浓度为10 U/ml时，呈现半凝固状态，即使增加凝血酶的体积也不能改变其半凝固状态，因此本实验选择凝血酶浓度为40 U/ml。

2.2.3 凝血酶滴加体积对抗凝血酶活性测定的影响 每次凝血酶滴加的体积影响凝固稳定状态，当每次滴加 2．5 μl和 10 μl时，极易出现半凝固状态，之后即使再滴加凝血酶也不能改变其半凝固状态，因此本实验凝血酶每次滴加体积为5 μl，凝固状态稳定。

2.2.4 凝血酶滴加间隔时间对抗凝血酶活性测定的影响 凝血酶不同滴加时间间隔影响凝固稳定状态，当使用浓度为40 U/ml凝血酶时，滴加时间间隔＜2 min时，可呈现稳定的凝固状态，随着时间间隔的增大反而不能增加凝固状态的稳定性，呈现半凝固状态。因此该实验凝血酶滴加间隔时间＜2 min。

3 讨论

地龙为《中国药典》2015年版收载品种，具有清热定惊，通络，平喘，利尿作用，用于高热神昏，惊痫抽搐，肢体麻木半身不遂等症，临床主要用于脑梗死、高血压等疾病的治疗［6］。研究表明地龙提取液具有 抗 凝 、 促 纤 溶 和 改 善 血 液 循 环 等 作 用［8，9］，1983年，Mihara首次从地龙中提取分离出具有抗凝和溶栓活性的蛋白质——蚓激酶，为其抗凝活性物质提供了有利的证据［10］，同时为含地龙药品的质量评价和临床疗效提供了资料。有研究建立复方地龙胶囊的质量标准，将其的抗凝血强度值设置为不低于12840 U/g［2］。水蛭是《中国药典》2015 年版规定抗凝血活性检测的中药材，其抗凝血值不低于 16．0 U/g［6］，因此该文选择其作为阳性对照。蝮蛇毒是从蝮蛇毒腺中分泌出来的一种毒液，含有多种活性酶及蛋白质，具有多种生物活性和药理活性，通常被作为抗栓酶使用［3］。人参再造丸中就含有地龙和原蛇毒［6］，具有活血通络，作用，用于气虚血瘀，风痰阻络所致的中风。1981年国内注射用蝮蛇毒剂应用于临床，但因为毒性大而停止使用［11］。2009年，由尖吻蝮蛇蛇毒提取物研制的药物“苏灵”上市，用于治疗各种血管栓塞性疾病及预防血栓形成［12］。该制剂不仅含有动物药地龙，蝮蛇毒，还有活血化瘀作用的植物药丹参、川芎等，单采用阿魏酸的含量测定作为制剂质量控制的定量标准，无法将制剂质量与活血化瘀，通络养血的作用联系起来。因此，该实验为复方蝮蛇毒胶囊抗凝血药理作用与制剂质量标准相关性提供资料，参照《中国药典》2015年版水蛭的抗凝血酶活性测定实验进行，分别比较了地龙，蝮蛇毒，地龙+蝮蛇毒，植物药以及制剂的抗凝活性差异，发现地龙、蝮蛇毒和制剂的抗凝血活性均显著高于水蛭，其中以蝮蛇毒抗凝血酶活性最高，超过 160000 U/g，与报道蝮蛇毒在小剂量（0．0004～0．036 ku/kg）时显示抗凝血活性一致［13］，地龙抗凝血酶活性＞350 U/g。蝮蛇毒与地龙和中药材混合制成制剂后，其抗凝血酶活性有显著的降低，原因之一可能是药物之间的相互作用，降低了其抗凝酶活性；原因之二地龙+蝮蛇毒或者制剂的称量重量远远大于蝮蛇毒（1．08∶0．0144 或 7．2∶0．0144），在计算抗凝血酶活性时扩大了分母数值，从而使抗凝血酶计算数值远小于蝮蛇毒单品，但两者超强的抗凝血活性特别是蝮蛇毒的抗凝活性完全可以从实验现象中无法形成稳定的凝固状态发现的。此外，该制剂中含有的中药材成分也有一定的抗凝效果。研究结果表明，其抗凝血酶活性较水蛭要强，接近200 U/g，这些植物药的抗凝血活性与其文献报道一致［14］。鉴于制剂中植物药种类较多而未对单味药材进行一一比较，植物药单体成分是否具有抗凝血活性仍有待于进一步研究。

测定抗凝血酶活性时，供试品的浓度，凝血酶的浓度，每次滴加的体积和时间间隔都影响最终凝固状态的形成。该实验供试品的称量以水蛭抗凝血酶实验取样量1 g和患者一天最大制剂服用量为基础（6粒/次，3次/d），在多次凝血酶反应阳性且状态稳定的基础上，最终选择不同的样品采用了不同的稀释倍数。水蛭为原液，地龙、中药材和制剂样品为稀释20倍，蝮蛇毒单品和蝮蛇毒+地龙样品稀释120倍进行实验计算。在凝血酶选择40 U/ml，滴加体积为5 μl/次，时间间隔＜2 min时，所有样品均可以呈现稳定的凝固状态，重复性好。该实验表明蝮蛇毒是复方蝮蛇毒胶囊抗凝血酶活性最强的单味药，其次为地龙，这两者在本制剂活血化瘀功效中发挥至关重要的作用，这两味药的质量是该制剂质量的关键。通过实验条件摸索和反复测试，三个批号复方蝮蛇毒胶囊样品抗凝血酶活性平均为333 U/g，因此拟将复方蝮蛇毒胶囊的抗凝血酶活性暂定为≥300.0U/g。

该研究通过复方蝮蛇毒胶囊抗凝血酶活性的研究，建立质量标准与药理作用相关性评价，弥补了单纯以某味药物的含量测定作为药品质量控制方法的不足，更有利于对药品质量的控制；同时，该文对动物单味药的抗凝血酶活性研究也为动物药类质量标准的完善提供了资料。