2例西弗射盾子囊霉的分离与鉴定

陈菲 周万青 张之烽

(南京大学医学院附属鼓楼医院检验科，南京 210008)

西弗射盾子囊霉 (Stephanoascusciferrii)，又称西弗念珠菌 (Candidaciferrii)，是一种少见的条件致病性真菌[1]。由于抗生素、免疫抑制剂、激素的广泛应用，致使条件致病菌的感染机会增多，真菌病原谱也发生了很大变化，给临床诊断和治疗增加了难度。近年来，西弗射盾子囊霉在痰液、脑脊液、腹膜透析液、耳道分泌物、血液中均有分离成功的报道[1-5]。本文对2例西弗射盾子囊霉感染病例进行介绍，从形态学、培养特性及分子生物学等方面来说明检验技术对临床少见病原菌菌种鉴定和治疗的重要性。

1 材料及方法

1.1 病例资料

患者1，女，51岁，双耳间断性流脓数年，伴听力下降，常发生于感冒后。患者于1周前症状加重，于2017年6月21日来我院就诊并以“双侧慢性化脓性中耳炎”收入院。入院后专科检查见双侧鼓膜紧张部穿孔，鼓室内见少量脓性分泌物；听力检查示双侧中度传导性听力下降。实验室检查：血常规、生化、凝血未见异常，送检双份耳分泌物培养，均检出西弗射盾子囊霉。6月25日在全麻下行“左鼓室成形术+外耳道成形术+后上鼓室探查”手术同时予氟康唑抗感染，术后切口愈合好，无红肿渗出，准予术后1周出院。术后3个月随访未见异常。

患者2，男，59岁，因“肝移植术后1年余，反复肤黄尿黄眼黄伴发热7个月” 于2017年11月21日入院。患者既往因原发性胆汁性肝硬化导致肝衰竭行肝移植术、肝内胆管结石行PTCD术、经皮肾镜碎石取石术+经皮胆道取石术，另有腰椎陈旧性骨折、陈旧性腔隙性脑梗死等基础疾病。入院查体：体温38.9 ℃，脉搏112次/min，呼吸27次/min，血压135/87 mmHg，皮肤巩膜黄染，腹软，无压痛反跳痛。实验室检查：WBC 3.1×109/L，Neu 60%，Hb 62 g/L，C反应蛋白104.3 mg/L。腹部CT示肝内胆管结石，肝内包裹性积液；心脏超声示左心舒张功能减退。T管引流胆汁培养检出肺炎克雷伯菌与西弗射盾子囊霉。真菌葡聚糖495 pg/mL，真菌GM试验阴性。临床行比阿陪南+氟康唑抗感染治疗，培菲康调理肠道。2 d后患者热峰较入院时下降 (38.1℃)，提示抗感染治疗有效。但由于患者长期服用免疫抑制剂，基础免疫力极低，感染未完全纠正，反复发热，血钾仍在较低水平，并于12月6日出现呼吸、心率、血氧饱和度下降，抢救无效死亡。

1.2 试剂与仪器

Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统及配套YST鉴定卡、ATB FUNGUS 3真菌药敏检测条、哥伦比亚血琼脂平板 (法国梅里埃公司)；科玛嘉显色平板、沙保弱斜面培养基 (郑州博赛)；营养肉汤 (上海科玛嘉公司)；DNA提取试剂盒 (Qiagen)；PCR试剂 (上海生工公司)；引物及序列测定由上海生工公司完成。

1.3 细菌培养与鉴定

对于病例1，将耳分泌物标本直接接种哥伦比亚血平板，培养24 h后菌落涂片为真菌，转种科玛嘉显色平板以及沙保弱斜面培养基，分别置于35℃及28℃培养，24 h后连续观察菌落形态。经革兰染色后观察菌体形态。Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统及配套YST鉴定卡进行鉴定。

对于病例2，将胆汁标本置肉汤增菌24 h后转种哥伦比亚血平板，继续培养24 h后菌落涂片为真菌，转种科玛嘉显色平板以及沙保弱斜面培养基，分别置于35℃及28℃培养，24 h后连续观察菌落形态。经革兰染色后观察菌体形态。Vitek 2 Compact全自动微生物分析系统及配套的YST鉴定卡进行鉴定。

1.4 分子生物学鉴定

采用德国Qiagen试剂盒提取菌株DNA。参照文献[6]对真菌ITS1、ITS4进行PCR扩增。引物序列为ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR体系为50 μL：2×Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，无菌蒸馏水21 μL。反应条件参考文献进行。阳性产物委托上海生工公司进行双向测序，并将测序结果经PubMed进行Blast比对。

1.4 药敏试验

采用ATB FUNGUS 3真菌药敏检测条进行药敏试验，35℃孵育24 h后读取结果，具体参见试剂说明书进行。

2 结 果

2.1 菌落特征

2株菌株在哥伦比亚血琼脂平板、科玛嘉显色平板和沙保弱斜面培养基上均能生长，且菌落形态相似。科玛嘉显色平板上菌落特点：24 h菌落为无色，针尖状，接种环不易刮起，生理盐水中不易研磨；48 h后菌落稍大，逐渐显蓝绿色，72 h后菌落为蓝绿色，开始粗糙，凸出平板生长，1周后菌落呈规则圆形，灰蓝色，菌落中心明显凹陷 (见图1a)。

2.2 镜下特征

科玛嘉显色平板上培养24 h后涂片，革兰染色见菌丝，树枝状 (见图1b)；1周后取菌落涂片，见大量菌丝孢子，孢子沿菌丝周边分布 (见图1c)。

图1西弗射盾子囊霉培养菌落及革兰染色结果：a.科玛嘉显色平板35℃培养1周；b.科玛嘉显色平板35℃培养24 h革兰染色 (×1 000)；c.科玛嘉显色平板35℃培养1周革兰染色 (×1 000)

Fig.1The colonial morphology and Gram staining results ofStephanoascusciferrii: a. Colonial morphology on CHROM agar at 35℃ for 1 week; b. Gram staining ofStephanoascusciferriiat 35℃ for 24 h (×1 000); c. Gram staining ofStephanoascusciferriiat 35℃ for 1 week (×1 000)

2.3 生化鉴定

Vitek 2 Compact配套YST酵母菌鉴定卡鉴定结果为西弗射盾子囊霉，生物编码分别为6713567572777771，6713167572777571，可信度分别为97%与95%，重复鉴定结果一致。

2.4 分子生物学鉴定

经ITS测序及PubMed上Blast比对，2株菌序列与Trichomonascusciferrii(序列号:LC158132.1)同源性均为100%。

2.5 体外药敏结果

经ATB FUNGUS 3真菌药敏检测，2菌株体外最低抑菌浓度 (MIC)分别为：5-氟胞嘧啶≤4 μg/mL、两性霉素 B≤0.5 μg/mL、氟康唑≤1 μg/mL、伊曲康唑≤0.125 μg/mL、伏立康唑≤0.06 μg/mL。

3 讨 论

子囊菌隶属于真菌界 (Fungi)、子囊菌门 (Asco-mycota)、酵母纲 (Saccharomycetes)、酵母目 (Saccha-romycetales)、酵母菌科 (saccharomycetales)、子囊菌属 (Stephanoascus)[7]，西弗射盾子囊霉与孢子丝菌属和念珠菌属同源，但在形态特征差别较大，可通过有性繁殖在子囊中产生子囊孢子[8]。该菌是一种较为少见的条件致病菌，可在宿主免疫功能低下时导致感染[9]。本文2例患者，患者1常在感冒时出现双耳流脓；而患者2由于肝移植术后长期服用免疫抑制剂，机体处于免疫抑制状态，继发胆道感染，由于患者基础免疫力极低，临床抗感染治疗效果不佳。

由于西弗射盾子囊霉较为少见，对该菌的鉴定尤为重要。该菌在血平板、沙保弱培养基等临床常用培养基上均可生长，在科玛嘉显色平板上为灰蓝色凸起菌落，边缘整齐，随着培养时间的延长，菌落会出现凹陷，镶嵌于平板中，不易刮起，不易研磨。革兰染色涂片，可见菌丝，真菌孢子呈卵圆形沿菌丝排列。但仅仅靠上述特征进行鉴定较为困难。传统的真菌分类方法主要根据真菌的形态学、生理生化特点及生理生化指标来进行分析，但由于某些真菌属、种之间的形态学或生理生化差异极不显著，且真菌的培养和检出需要特殊培养条件和方法以及多数真菌的生长缓慢等特点的影响，给真菌鉴定工作带来困难[10]。分子生物学技术具有快速、灵敏、特异性高的特点，已被广泛运用于临床感染的诊断中，包括深部真菌感染的早期诊断。目前, 这些分子生物学检测方法多聚焦于对rDNA的内部转录间隔区 (internaltranscribedspacer,ITS)序列分析的研究，rDNA-ITS由于不加入成熟核糖体，所以受到的选择压力较小，进化速率较快，具有广泛的序列多态性，在其保守性上表现为在种内不同菌株之间高度保守，而在真菌种间差异明显，这种特点使得ITS适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析[11]。在临床检验工作中，不仅要熟练掌握基本的检验技术，如涂片镜检及观察菌落特点，更要学会将传统的培养法与分子生物学技术相结合，提高检验水平，早期快速、准确可靠地帮助临床诊断。

本文分离菌株药敏结果显示5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑均敏感。国外有分离出对抗真菌药物氟康唑耐药的菌株[12]。由于ATB FUNGUS 3真菌药敏检测条推荐用于念珠菌与隐球菌药敏测试，用于西弗射盾子囊霉还有待进一步研究[1]。