江西省致病性钩端螺旋体血清学和分子流行病学研究

，，，，

钩端螺旋体病(简称钩体病)是由致病性钩端螺旋体(简称钩体)引起的人兽共患传染病，主要通过直接或间接接触感染动物的尿液而感染，主要宿主动物包括啮齿类动物(黑线姬鼠、黄毛鼠、黄胸鼠和褐家鼠等)，以及家畜(猪、犬和牛等)。近年来以多位点序列分析(Multilocus sequence typing， MLST)为基础的分型方法，逐渐应用于细菌学基因分型、分子流行病研究。此外，细菌的16S rRNA具有高度的保守性已被广泛用于钩体菌基因种鉴定、分子进化的分析指标。江西省作为钩体病的老疫区，每年的钩体病发病率远高于全国平均发病率，而江西省的钩体病分子流行病学特征尚未见详细报道。本研究选取江西省2013年以来从宿主动物监测中分离到的27株钩体分离株，利用暗视野显微镜凝集试验进行血清群鉴定，利用16S rRNA基因测序技术对其进行基因种鉴定，以及利用MLST方法对其进行基因分型研究，初步探讨江西省致病性钩体的血清学、分子流行病学特征，为江西省钩体病预防控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源 本研究共选用江西省2013年以来啮齿类动物监测中分离到的27株钩体分离株，分别来自上饶、上高、浮梁和上犹4个地区。

1.2主要试剂 15群15型钩体参考菌株诊断血清由中国食品药品检定研究院提供；PCR Premix采用大连宝生物工程(大连)有限公司产品；100 bp DNA Marker采用北京天根生化科技有限公司产品；基因组提取采用北京赛百盛基因技术有限公司硅胶膜型TM基因组DNA提纯试剂盒。

1.3血清群鉴定 采用暗视野显微镜凝集试验(Microscopic agglutination test，MAT)，利用中国15群15型钩体参考菌株的免疫兔血清，对分离菌株进行血清凝集试验，利用暗视野显微镜观察，以出现50%菌体凝集菌群为最终鉴定血清群。

1.4菌体DNA制备 钩体液态培养基在28 ℃培养7～10 d，达到对数生长期提取基因组DNA，操作方法按试剂盒说明书进行。

1.516S rRNA基因PCR扩增、测序 参照参考文献[1]报道的引物序列进行PCR扩增、双向测序，引物序列如下：fDl：5′-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，rP2：5′-CCC-GGGATCCAAGCTTACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。采用50 μL PCR反应体系扩增，Premix ExTaq25.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2 μL，cDNA模板5 μL，纯水补充至50 μL反应体积。PCR扩增参数如下：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，扩增30个循环，最后72 ℃延伸 10 min。PCR产物纯化、双向测序由宝生物工程(大连)有限公司完成。

1.6MLST七个位点PCR扩增、测序 参考文献报道MLST方案[2]，利用7个位点pntA、sucA、pfkB、tpiA、mreA、gluM、caiB进行PCR扩增，各位点信息见表1，引物合成由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。采用20 μL反应体系进行扩增，Premix ExTaq10.0 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板1 μL，纯水补充至20 μL反应体积。PCR 扩增程序如下：95 ℃ 预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，扩增30个循环，最后72 ℃延伸 10 min。扩增产物纯化、双向测序，由宝生物工程(大连)有限公司完成。

1.7 数据分析

1.7.1基因种鉴定 将测序获得的16S rRNA基因序列与GenBank数据库进行同源性比对，以确定其基因种。

1.7.2MLST研究 将7个位点序列与MLST网站http://pubmlst.org/上相应等位基因进行比较，获得每株菌等位基因谱(gluM-pntA-sucA-tpiA-pfkB-mreA-caiB)以及STs (Sequence Types)型别。利用BioNumerics软件进行聚类分析，观察菌株间的基因多态性及种群结构。

表1 MLST研究中7个位点信息Tab.1 Seven loci in MLST analysis

2 结 果

2.1血清群鉴定 经MAT试验结果显示：27株江西省致病性钩体分离株隶属于4个血清群，分别是黄疸出血群、爪哇群、澳洲群和巴达维亚群。其中黄疸出血群为江西省主要优势血清群，占59.26%(16/27)，其次依次为爪哇群占25.92%(7/27)、巴达维亚群占7.41%(2/27)和澳洲群占7.41%(2/27)。血清群分布存在一定程度的地域差异，浮梁和上饶地区以黄疸出血群为主，上犹地区以爪哇群为主，上高地区仅分离到一株菌株，为澳洲群，详见图1。

图1 27株江西省钩端螺旋体菌株不同地区血清群分布Fig.1 Distribution of Serogroups among different regions for 27 Leptospira strains isolated from Jiangxi Province

2.2基因种鉴定 27株分离株的16S rRNA基因测序结果与GenBank数据库收录的钩体16S rRNA基因序列比对，同源性>99.7%认为是同一个基因种，结果显示：27株菌株隶属于L.interrogans和L.borgpetersenii2个致病性基因种，其中L.interrogans为江西省主要优势基因种，占77.78%(21/27)。基因种分布存在一定的地域差异，例如L.borgpetersenii基因种仅存在于江西省上犹监测点，而L.interrogans基因种广泛存在于上饶、上高、浮梁和上犹4个监测点，详见图2。

图2 27株江西省钩端螺旋体菌株不同地区基因种分布Fig.2 Distribution of species among different regions for 27 Leptospira strains isolated from Jiangxi Province

2.3MLST基因多态性分析 MLST研究结果显示，27株致病性钩体呈现5个ST型别，其中ST1为主要优势ST型别，占59.26%(16/27)，其次依次为ST143占22.22%(6/27)、ST105占7.41%(2/27)、ST224占7.41%(2/27)和ST216占3.70%(1/27)。ST分布也存在一定程度的地域差异，ST1分布在浮梁和上饶地区，ST143仅分布在上犹地区，ST105分布在上饶和上高地区，ST216和ST224仅在上犹地区分布，详见图3。

图3 27株江西省钩端螺旋体菌株ST型别在不同地区分布Fig.3 Distribution of sequence types (STs) among different regions for 27 Leptospira strains isolated from Jiangxi Province

2.4BioNumerics软件分析 UPGMA聚类分析显示：27株菌株共分为5个Cluster群，分别对应5种ST型，详见图4。Cluster1对应ST224，来自2015年上犹菌株；Cluster2对应ST216，为2014年上犹菌株；Cluster3对应ST105，来自2013年上饶和2015上高菌株；Cluster4对应ST1，为江西省的优势克隆群，包括16株2013、2014年上饶和2013-2015年浮梁菌株；Cluster5对应ST143，来自2013-2015年上犹菌株。由聚类图显示：ST和血清群构成在不同地域上均存在一定程度差异，而不同年代间差异不明显，ST型别在宿主特异性方面也不明显。黑线姬鼠作为主要宿主，包括ST224、ST216、ST1和ST143四个ST型。

L.int: L.interrogans, L.bor: L.borgpetersenii.图4 27株江西省钩端螺旋体UPGMA聚类分析Fig.4 UPGMA dendrogram of 27 Leptospira strains isolated from Jiangxi Province

3 讨 论

江西省是钩体病的老疫源地，该省每年均有数例钩体病上报病例，本研究黄疸出血群为江西省主要流行血清群，其次为爪哇群，L.interrogans为主要致病性基因种，ST1为主要优势ST型别，其次为ST143。徐建民[3]等2010年对2002-2008年的江西监测菌株进行PFGE研究发现：黄疸出血群赖型是江西省人群及动物中优势血清型，本次研究中2013年以来江西主要流行型别在不同年代间变化不大。李世军等[4-5]对2007-2009年分离自贵州的菌株进行研究发现：3株分离株均隶属于L.interrogans基因种，黄疸出血群和ST1型别。王亚琳等[6]报道2010年四川乐至县人群钩体疫情主要致病群血清群为黄疸出血群。综上所述，江西的主要流行株与中国四川、贵州等其他地区的主要流行菌群、型别一致。

本研究发现江西地区钩体的基因种、血清群及ST型别分布存在地域差异。有文献报道L.interrogans基因种更适合在潮湿的环境生存，而L.borgpetersenii基因种在潮湿和干燥的环境均能生存[7]。有实验数据表明：L.interrogans适合在外环境例如外界表面水体中生存，可通过接触疫水传播钩体病，而L.borgpetersenii基因种不容易在外界环境生存，主要通过宿主动物间的直接传播[8]。上犹处于江西的赣南山地地区，海拔在1 000～1 600 m左右；而上饶、上高和浮梁处于赣北丘陵地区，海拔在100～300 m左右，可能不同的海拔高度、地理位置、气候、宿主动物、环境等因素会影响钩体生存、传播，具体的致病、传播机制尚需进一步验证。

Thaipadungpanit等[9]对2000-2005年泰国东北部钩体疫情进行MLST分析，研究发现L.interrogans秋季群ST34为主要的优势克隆群。Guernier等[10]对法国波利尼西亚塔希提地区的猪、鼠、人进行钩体检测，研究发现该地区存在L.interrogans和L.borgpetersenii2个基因种和3种ST型别，其中L.interrogans是主要致病基因种，LeptospirainterrogansST140仅在猪中发现，L.interrogansST17和LeptospiraborgpeterseniiST149在人和猪中均检测到。Voronina等[11]对俄罗斯29株钩体分离株进行分析，研究发现该地区存在L.interrogans、L.kirschneri和L.borgpetersenii三个基因种，其中ST37、ST17、ST 199(L.interrogans)、ST110(L.kirschneri)和ST146(L.borgpetersenii)五个ST型别从时间和地域上在该地区普遍存在。Benacer 等[12]对马来西亚半岛的城市鼠类进行钩体检测，研究发现：L.interrogans为主要基因种，巴达维亚群和爪哇群为主要流行血清群，ST143和ST50为主要流行ST型别。综合国内、国际钩体病文献报道发现，中国以及世界的常见致病基因种为L.interrogans和L.borgpetersenii基因种，以L.interrogans基因种为主，但是不同国家和地区又同时存在一些独特的ST型别，例如江西的主要流行型别ST1在其它国家尚未见报道。同时，中国江西钩体菌株基因多态性较高，优势ST型别ST143及优势血清型爪哇型与马来西亚半岛的钩体病流行型别相同，可能与同为东南亚国家，当地的地理位置、气候及环境因素相似有一定关系，具体的详细机制尚需进一步的实验验证。

本次江西钩体菌株的血清学、分子分型研究为江西省钩体病的分子流行病学研究提供了科学依据。