鹤庆新发野鼠鼠疫疫源地中鼠疫噬菌体的分离及其裂解谱测定

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历史上，鹤庆县于1772年、1778-1796年、1879-1888年在东区有过3次较大的鼠疫流行。1985年在鹤庆县草海镇的马厂村、 新峰村的狗血清和鼠血清中发现鼠疫抗体放射免疫阳性4份[1]，1990年后开始每月在新峰、马村进行鼠疫监测，但一直未发现鼠疫更多线索。直至2017年4月，鹤庆县疾病预防控制中心鼠防人员在草海镇马厂村进行鼠疫常规监测时，发现鼠疫菌阳性，并在随后的扩大调查中，陆续从活鼠中分离到10余株鼠疫菌株，从而确定马厂村发生鼠间鼠疫流行[2]，鹤庆县也正式成为建国后云南省的新发野鼠鼠疫疫源地。

鼠疫噬菌体一直被用来进行鼠疫病原体的鉴定[3]，在自然界中与鼠疫菌存在竞争和共进化的复杂关系。只要有鼠疫菌存在的地方就有鼠疫噬菌体的踪迹[4]，那么作为新发疫源地，鹤庆鼠疫疫源地内是否也存在着鼠疫噬菌体，其分布率如何，生物学特性如何，一系列的疑问的回答是更深入了解此疫源地的有益线索，是做好此块疫源地鼠疫防控工作的基础工作。本研究就此进行了调查研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1样本采集 采样主要以鹤庆县草海镇马厂村为中心向周围5 km范围调查采样，包括鹤庆县草海镇的马厂、小马厂、黑泥绍及安乐等4个自然村。采用鼠铗法(5 m铗线法)捕获老鼠，于实验室中无菌剖解，并在无菌条件下取鼠肠道2cm左右，立即放入置有5 mL 改良PBS增菌液(Fluka，peptone sorbitol bile brother)的离心管中，于4 ℃冰箱中保存待检。

1.2噬菌体分离宿主菌EV76的活化 本实验以鼠疫菌株EV76作为噬菌体分离的宿主菌。从-80 ℃冰箱中取出含株保存的EV76疫苗株(本实验室保存)，接种于含1%的兔溶血LB平皿上， 28 ℃温箱中培养24 h，挑取单个菌落，在LB平皿上三道划线，28 ℃温箱培养48 h，挑取单菌落进行增殖备用。

1.3鼠疫噬菌体的分离与纯化 采用双层平板法进行噬菌体的分离纯化，具体为：将上述样本经0.22 μm滤膜(美国Millipore)过滤，并加入到含有对数生长期EV76菌悬液100 μL的15 mL离心管中，置恒温气浴振荡培养箱28 ℃、220 r/min振荡培养24 h；再次过滤增殖液，并取300 μL与150 μLEV76菌悬液充分混匀，然后加入到6 mL的半固体培养液(50 ℃)中，混匀铺板；待半固体凝固后分别置于28 ℃和37 ℃温箱中培养24 h。如若有噬菌斑出现，该样本则为阳性样本，从双层平皿上挑取生长状况良好的单个菌斑进行增殖培养。6次单斑增殖后平皿上可见形态大小一致的噬菌斑，将其视为纯化好的噬菌体[5]。

1.4噬菌体的电镜观察 取2 mL纯化好的噬菌体样本和1 mL的宿主EV76混匀加入到有6 mL液体培养基的增菌管中，放入空气摇床28 ℃，220 r/min，培养24 h。取出增殖液0.22 μm滤膜过滤，加入EV762 mL继续培养，如此重复3次，得到浓缩后的噬菌体菌液，取20 μL(噬菌体效价为1×108)滴于石蜡片上，采用醋酸双氧铀染色，置于铜网上进行电镜(日立HT7700)观察。

1.5噬菌体不同温度下裂解谱观察 温度设定：通过预实验选取24 ℃、28 ℃、37 ℃作为本研究的实验温度。受试菌株的选择：选用21株鼠疫分离株分别是：鹤庆(10株)、丽江(3株)、剑川(3株)、以及云南家鼠鼠疫菌株(4株)。非鼠疫菌株115株来自于：云南省地方病防治研究所保存的小肠结肠炎耶尔森菌(20株)，其余95株不同种属菌株由大理市第一人民医院以及大理州医院提供。

1.6实验数据统计分析方法 采用Photoshopcs3进行噬菌体电镜照片中噬菌体大小的测量，以及Microsoft Excel进行数据统计整理，采用SAS 9.4进行卡方分析，P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1分离情况 此次调查共采集成年活鼠标本共354份，经筛查共检出鼠疫噬菌体阳性样本2份，阳性率为0.56%。4个采样自然村中只有马厂村分离到了2株鼠疫噬菌体，其余小马厂、黑泥绍及安乐村未分离到鼠疫噬菌体，经检验4个自然村噬菌体分离率差异无统计学意义(χ2=0.706，P>0.05)，见表1。从宿主动物上看：共有大绒鼠、齐氏姬鼠、社鼠、臭鼩鼱及黄胸鼠5种，大绒鼠占72.60%，但从中未分离到鼠疫噬菌体，2两株噬菌体分别分离自齐氏姬鼠及臭鼩鼱，详见表2。经检验5种宿主动物之间噬菌体分离率的差异有统计学意义(χ2=23.91，P<0.05)。采用分割法两两比较，臭鼩鼱分离率高于其他宿主动物。

2.2所分离到两株噬菌体的噬菌斑形态 分离到的两株噬菌体命名为HQ1和HQ2。刚分离出的噬菌体生长状态较差，经过6次纯化增值后，在28 ℃和37 ℃条件下培养24 h在双层琼脂平板上形成圆形、透明、边缘清晰的噬菌体，28 ℃条件下直径为1～1.5 mm，37 ℃条件下噬菌斑直径增大到2～3 mm(图1)。

2.3噬菌体电镜形态 醋酸双氧铀负染后在电子显微镜下观察，鹤庆分离的两株鼠疫耶尔森噬菌体的形态如HQ1噬菌体头部呈正六面体结构，头部直径约45.42 nm，尾部长约108.17 nm; HQ2噬菌体头部也呈正六面体结构，头部直径约37.88 nm,尾部长约121.85 nm(图2)。两株噬菌体的电镜形态显示，噬菌体含非收缩性尾部，根据2011年国际病毒分类委员会第9次报告提出的噬菌体分类与命名标准，两株噬菌体符合肌尾噬菌体科特征[6]。

表1 鹤庆县草海镇4个自然村噬菌体分离情况Tab.1 Phage separation in 4 natural villages in Caohai Town, Heqing

表2 鹤庆县草海镇不同宿主动物鼠疫噬菌体的分离情况Tab.2 Isolation of plague phage from different host animals in Caohai Town, Heqing

A：HQ1在28 ℃下对EV76的噬菌斑；B：HQ2在28 ℃下对EV76的噬菌斑；C：HQ1在37 ℃下对EV76的噬菌斑；D：HQ2在37 ℃下对EV76的噬菌斑。图1 鹤庆县2株鼠疫噬菌体不同温度下噬菌斑图Fig.1 Plaque pattern of two plague phage in Heqing at different temperatures

图2 鹤庆县2株鼠疫噬菌体电镜形态Fig.2 Electron microscopic morphology of two plague phage in Heqing

2.4噬菌体不同温度下裂解特性测定 所分离2株鼠疫噬菌体对于21株鼠疫菌(包括EV76)的裂解特性相同，即22 ℃与24 ℃下不裂解，28 ℃与37 ℃裂解，且37 ℃下的裂解性较28 ℃要强。对于115株非鼠疫菌，两株噬菌体对在22 ℃、24 ℃、28 ℃和37 ℃状态下均不裂解。该结果进一步表明，所分离的噬菌体为鼠疫噬菌体。详见表3与图3。

1代表诊断噬菌体，2代表HQ1，3代表HQ2图3 鹤庆县2株鼠疫噬菌体不同温度下裂解鼠疫菌图Fig.3 Analysis of plague plaques from two plague phage of Heqing at different temperatures

表3 不同温度下鹤庆噬菌体对136株受试菌株的裂解情况Fig.3 Lysis of 136 strains of Heqing phage at different temperatures

“-”表示未裂解，“+”表示裂解

3 讨 论

3.1鹤庆新发鼠疫疫源地中存在着鼠疫噬菌体 2017年4月，云南省鹤庆县从捕获的350多份活鼠(及其寄生蚤)中分离到10株鼠疫菌，并证实这些鼠疫菌株与丽江野鼠鼠疫疫源地菌株具有很高的同源性，鹤庆疫情可能是丽江鼠疫进一步向南扩散的结果[7]。从1772至1937年间，鹤庆县流行鼠疫50年次，累计死亡15 000人，此后再也没有疫情报道[1]，1937到2017年过去了80年。2017年又监测到鼠间疫情，且从活鼠中检出鼠疫菌，分离率近3%，这说明鼠疫在这一地区一直存在，一个古老而又未解的疑问又提出来了，鼠疫菌在这一地区又是怎样保存的，鼠疫菌的微生态研究也许是揭开这一迷团的一把钥匙，其中鼠疫噬菌体在鼠疫微生态学研究中扮演了十分重要的角色。

本研究证实，在这一古老的新发鼠疫疫源地中确实存在着鼠疫噬菌体，而噬菌体的分离地与鼠疫菌的分离地都是在马厂村，这更说明了鼠疫菌与鼠疫噬菌体相辅而存、协同进化的关系。从分离宿主上看，虽然大绒鼠疫是此地占绝对优势的鼠种，但并未从其体内分离到鼠疫噬菌体，而在分布较少的齐氏姬鼠上则分离到一株鼠疫噬菌体，这与齐氏姬鼠在野鼠疫源地中对鼠疫菌为高感受性、低敏感性及中等抗性，这与鼠疫菌的贮存宿主[8]的研究相对应，也间接印证了其在疫源地中充当鼠疫菌贮存宿主的这一角色。

3.2鹤庆分离鼠疫噬菌体特殊的裂解温度依赖性及其生物学意义 此次分离到的两株鼠疫噬菌体刚分离时生长状态较差，经纯化和传代培养后生长状态明显改善。纯化后经测定得到其最适生长温度为37 ℃，而鼠疫诊断噬菌体最适裂解温度在25～28 ℃[9]。鹤庆分离噬菌斑与李存香等分离自玉龙，剑川等地噬菌体在生长状态、噬菌斑直径、最适生长温度等方面均存在一定差异[10-11]。此次分离的两株噬菌体只有在28～37 ℃温度范围内对鼠疫菌有较强的裂解特性，低于25 ℃下不裂解鼠疫菌。这种特性，使其与鼠疫菌在自然条件下(马厂村位于鹤庆县草海镇西山，距县城35 km，海拔2 980 m，年平均气温13.5 ℃，年降水量900 mm)可以共存活，而在动物体内(37 ℃)该噬菌体则可裂解鼠疫菌。这样的特性既保证了鼠疫菌在自然界中(如鼠巢、土壤中)的存留，又不至于使鼠疫菌在动物间广泛传播形成大的流行。

2017年4月鹤庆发生了鼠间鼠疫流行，一种推测可能是：由于长期的鼠疫较低流行，使鼠疫噬菌体在这一地方的丰盛度大大降低，从而感染鼠疫的宿主动物能同时接触到此种噬菌体的概率就降低，因而鼠疫菌在动物体内失去了“天敌”，继而鼠疫又流行起来。随着动物间鼠疫的大流行后，鼠疫噬菌体的丰盛度又会增加，继而鼠疫的流行又会被鼠疫噬菌体抑制而逐渐减弱。同时噬菌体作为一类裂解性杀菌病毒，有严格的宿主特异性，对人和动物均无害[12]，因此从鼠疫生物防控的角度，只要在这一地方投放含有这种鼠疫噬菌体的老鼠饵料，从而增加鼠疫噬菌体在这一地区宿主动物中的丰盛度，自然会降低鼠疫动物间流行的风险，从而降低涉及到人的可能；同时采用这种属地分离鼠疫噬菌体进行投放，对当地整个微生态的影响更小，更为安全可靠，不至于造成外源噬菌体(如诊断用噬菌体)对鼠疫菌及其生态带来不可预测的风险。

当然，是什么机制导致对这两株鼠疫噬菌体具有如此独特的温度依赖性裂解鼠疫菌的特性，仍是我们所未知的。随着我们对这两株鼠疫噬菌体测序的完成，更多生物学指标的测定，我们将逐步揭开此神秘的面纱。而这些问题的解决，对于我们认识鼠疫保存机制，进而制定更科学的鼠疫防控策略，无疑是重要支撑。