芹黄素对氧化应激诱导的HaCat细胞XBP1表达的影响

张德利 ，刁庆春 ，涂彩霞 ，林茂

（1.西南医科大学，四川泸州646000；2.重庆市中医院，重庆400011；3.大连医科大学第二附属医院，辽宁大连116027）

白癜风是一种常见的获得性的色素脱失性皮肤病，发病机制不清，治疗困难。近年来，有学者提出白癜风的综合发病机制学说：在遗传学背景基础上，氧化应激造成局部黑素细胞损伤及凋亡，诱导自身免疫反应攻击更多的黑素细胞，造成进行性的皮肤色素脱失[1]，但氧化应激如何启动自身免疫反应尚不清楚。

遗传学研究显示，白癜风X-box结合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）启动子区域的遗传变异与白癜风发病密切相关，且皮损中XBP1表达明显增加[2]。XBP1是一种多功能核转录因子，被剪切后的XBP1（XBP1s）可调节多种下游基因转录，可能促进黑素细胞黑素小体自噬，释放自身抗原[3]；促进B细胞活化[4]，分泌针对黑素细胞的自身抗体；促进树枝状细胞传递自身抗原[5]，激活CD8+T细胞攻击黑素细胞，从而引发自身免疫反应，破坏黑素细胞，因此可能是氧化应激引起的白癜风自身免疫反应中的关键因素。

黄酮类化合物在多种细胞系中具有强大的抗氧化生物学效应[6]。芹黄素属于黄酮类化合物，广泛存在于芹菜、大蒜、苹果等蔬菜水果，及地钱、西藏雪莲花等中草药中[7]。笔者前期研究发现，芹黄素可通过抑制ROS产生，减少氧化应激引起的黑素细胞凋亡[8]。但芹黄素可否可抑制氧化应激引起的XBP1表达升高，从而抑制其自身免疫激活，目前尚未见报道。因此，本文拟通过建立体外过氧化氢诱导的角质形成细胞氧化应激模型，检测芹黄素对氧化应激诱导的XBP1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器

1.1.1 材料

1.1.1.1 细胞 人永生化HaCat细胞株购自上海生博生物医药科技有限公司。

1.1.1.2 主要试剂 芹黄素（Apigenin，Sigma，美国）、30%过氧化氢（H2O2，Sigma，美国）、N－乙酰半胱氨酸（Acetylcysteine，NAC，Sigma，美国）、胰蛋白酶（Gibico，美国）、乙二胺四乙酸（EDTA，Sigma，美国）、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（MTT，Sigma，美国）、2'，7'-二氯氢化荧光素探针（DCFDA，Sigma，美国）。RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒（Takara，日本）。PCR引物由Takara公司大连分公司合成。

1.1.2 仪器 自动酶标仪（Thermo，芬兰）、流式细胞仪（Becton Dickinson，美国）、7500型实时定量PCR检测仪（ABI，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HaCat细胞株常规方法复苏后，用含10%胎牛血清DMEM低糖培养基，5%CO2培养箱培养（37℃，相对湿度95%），2～3 d传代1次，取对数生长期细胞制成5×104/mL单细胞悬液，接种于96孔板或6孔板后继续培养。

1.2.2 细胞活力测定 不同浓度的芹黄素作用于HaCat细胞12 h后，采用四甲基偶氮唑兰比色法（MTT法）。96孔板每孔加5 g/L MTT溶液20 μL，继续培养4 h后，弃上清，每孔加100 μL DMSO，低速震荡5 min，酶标仪测定吸光度值，测定波长490 nm。

1.2.3 活性氧含量检测 采用DCF-DA法[9]。培养的HaCat细胞加入25 μmol/L芹黄素或10 mmol/L的NAC（阳性对照）预处理1 h，再加入500 μmol/L的H2O2作用12 h，空白对照组及阴性对照组处理同上。培养细胞加入10 μmol/L DCF-DA，37℃孵箱中孵育30 min，消化收集细胞，用预冷的PBS洗3次，流式细胞仪检测荧光强度，检测波长488/525 nm。

1.2.4 实时定量PCR检测 细胞经0.25%胰蛋白酶消化、离心，收集细胞，利用TaKaRa细胞总RNA抽提试剂盒提取各组细胞总RNA，采用TaKaRa反转录试剂盒按照说明书以RNA为模板反转录为cDNA，采用荧光定量PCR试剂盒按照说明书以cDNA为模板进行PCR反应，然后使用ABI 7500 PCR仪进行荧光PCR。引物序列见表1。实时定量PCR反应条件：94℃预变性3 min，扩增40个循环，每循环中，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s，采集荧光信号；40循环结束后，经94℃30 s、57℃30 s、72℃45 s，采集熔解曲线。使用7500型Real-time PCR仪分析软件进行数据分析。以GAPDH为内参基因，计算同一样本中目的基因与内参基因的含量比值，评价目的基因的表达水平。每个样本取3个复孔，PCR重复3次。

表1 引物序列

2 结果

2.1 芹黄素对HaCat细胞活力的影响 芹黄素浓度≤25 μmol/L时，对HaCat细胞活力无明显影响，无细胞毒性（P＞0.05），见图 1。

图1 芹黄素对HaCat细胞活力的影响

2.2 芹黄素抑制过氧化氢引起的HaCat细胞ROS含量升高 500 μmol/L的过氧化氢可显著诱导Ha－Cat细胞 ROS 含量升高（P＜0.01）；10 μmol/L 及 25 μmol/L的芹黄素可显著抑制过氧化氢引起的HaCat细胞ROS含量升高，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。

图2 芹黄素对H2O2引起的HaCat细胞ROS含量升高的影响

2.3 芹黄素抑制过氧化氢引起的HaCat细胞的XBP1s mRNA表达升高 500 μmol/L的过氧化氢可显著诱导HaCat细胞XBP1s mRNA表达（P＜0.01）；10 μmol/L及25 μmol/L的芹黄素可显著抑制过氧化氢引起的HaCat细胞XBP1s mRNA表达升高，差异有统计学意义（P<0.01），见图3。而过氧化氢或芹黄素对Hacat细胞未剪切的XBP1（XBP1u）的mRNA水平无明显影响，见图4。

图3 芹黄素对H2O2引起的HaCat细胞XBP1s mRNA表达升高的影响

图4 芹黄素对H2O2引起的HaCat细胞XBP1u mRNA表达升高的影响

3 讨论

在白癜风的发病机制研究中，近年来发现XBP1可能在氧化应激诱导自身免疫的过程中起重要作用。XBP1是未折叠蛋白应答（Unfolded protein response，UPR）信号通路中的标志性信号之一。氧化应激可引起内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ER stress），激活 UPR，使得 XBP1 mRNA 发生剪切，剪切后的XBP1即XBP1s，转移到细胞核，调节多种自身免疫相关的基因表达[9]。最近的研究发现XBP1活化可促进角质形成细胞分泌趋化因子CXCL 16，诱导CD8+T淋巴细胞趋化；还可促进黑素细胞产生IL-6、8[10]，可促进B细胞分化为浆细胞分泌抗体[4]，可维持树枝状细胞存活和功能[5]；还可调节细胞自噬[3]。因此，对XBP1的调控可能有助于阻断白癜风氧化应激诱导的自身免疫反应，成为重要的治疗靶点。在本研究中，笔者根据前期文献报道[11]，选用500 μmol/L的过氧化氢诱导角质形成细胞氧化应激，并证实其可明显增加XBP1s的表达，可用于抗氧化药物的检测。

芹黄素是黄酮类化合物，具有明显的体内及体外抗氧化作用[7]，笔者前期研究发现，芹黄素可通过抑制ROS产生，减少氧化应激引起的黑素细胞凋亡[8]；但其是否对角质形成细胞的氧化应激具有拮抗作用，是否对XBP1的表达具有调控作用尚未见报道。本研究中，笔者发现芹黄素浓度小于或等于25 μmol/L时，对HaCat细胞活力无明显影响。10 μmol/L及25 μmol/L的芹黄素可显著抑制过氧化氢引起的HaCat细胞ROS含量升高，显著抑制过氧化氢引起的HaCat细胞XBP1s mRNA表达升高，而对未剪切的XBP1（XBP1u）的mRNA水平无明显影响。这些结果说明，芹黄素可能通过抑制XBP1s表达，对白癜风氧化应激诱导的自身免疫具有一定的拮抗作用。

综上所述，芹黄素可能通过抗氧化，对过氧化氢引起的XBP1s表达升高具有抑制作用，因而可能具有开发成为治疗白癜风的新药的前景。