丹皮酚通过抑制树突状细胞活性在咪喹莫特诱导的银屑病皮肤病中的作用研究

丁文，杜恭韶，万永山，李玉萍

（安阳市人民医院，河南安阳 455000）

银屑病近年在我国患病率逐步攀升，临床以局部皮肤鳞屑、浸润、红斑为主要症状的自身免疫性疾病[1]。药物对皮损的治疗主要通过改善皮损积分，作用皮损细胞和组织的生长等发挥作用。丹皮酚（Paeonol）是中药材丹皮中提取出来的小分子化合物，也是丹皮发挥抗炎作用的有效成分[2]。本研究通过体内实验和骨髓细胞体外实验相结合，旨在探讨丹皮酚对DCs抑制作用，综合评价丹皮酚对银屑病的治疗前景。

1 材料与方法

1.1 动物 实验动物8～10周龄BALB/c雄性小鼠由山东鲁抗药品公司提供，体质量（20±2）g，实验动物许可证编号：SCXK（京）2016-0013。将实验用鼠按照随机数字表法平均分为6组，分别为空白对照组（Con）、模型组（Model组/IMQ 组）、甲氨蝶呤组（MTX组）及丹皮酚高（PG-H）、中（PG-M）、低（PGL）剂量组，以上每组10只，均饲养于SPF级动物室。

1.2 药品与试剂 丹皮酚(国家研究院食品药品检验所，中国，北京）；咪喹莫特乳膏（四川明欣药业有限责任公司产品，批号：101112）；凡士林（河北兰炼飞天石化有限公司产品，批号：Z31200147）；DAB显色液（中杉金桥生物技术有限公司）；CD3单克隆抗体（Abcam公司，英国）；CD11c单克隆抗体（Abcam公司，英国），CD11c-PE单克隆抗体（eBioscience公司，中国，上海）；抗鼠白细胞介素（IL）-23（Santa Cruz公司，美国）；CCK-8试剂盒（日本同仁化学）。

1.3 BMDCs骨髓细胞分离及体外诱导培养实验[3-5]采用BMDCs细胞株（上海赛百慷生物技术股份有限公司）。体外诱导培养10周龄BALB/c小鼠的股骨和胫骨骨髓细胞。BMDCs骨髓细胞体外培养应用含有10%（体积分数）胎牛血清（Gibco Life技术，格林德艾兰，NY，美国）、1%青霉素、1%链霉素、20 g/L的IL-4和20 μg/L的GM-CSF的培养液，置于37℃、5%（体积分数）CO2恒温培养箱中培养7 d诱导DCS和补充介质，定期换液及观察细胞形态，选取细胞备用。

1.4 动物造模、给药及取材

1.4.1 动物处理 在实验前对本次实验用的所有小鼠，戊巴比妥钠麻醉并除去背部同1个部位约2 cm2面积的毛发，备皮后单笼饲养。

1.4.2 分组动物实验 ①空白对照组：小鼠背部裸露处每日涂抹适量凡士林，予生理盐水0.4 mL/次，1次/d；②模型组：银屑病小鼠模型是选择实验小鼠参照文献[6-7]建立IMQ诱导的银屑病模型，于背部裸露处每日涂抹约420 ng体积分数4%的IMG，模型组小鼠给药按照生理盐水注射1次/d，0.4 mL/次；③甲氨蝶呤组，在动物模型制作成功的基础上予MTX 1 mg/kg,1次/d；④丹皮酚高、中、低剂量组小鼠在动物模型制作成功的基础上分别予100 mg/（kg·d）、50 mg/（kg·d）、25 mg/（kg·d）的丹皮酚灌胃[8]。给药连续7 d，第8天取材，第14天后，断颈处死，在戊巴比妥钠麻醉下采集皮肤病变和血清标本。

1.5 检测和实验

1.5.1 皮损组织IL-23、CD11c+及CD3+检测[9]采用免疫组织化学法（IHC）对小鼠皮损组织石蜡切片进行CD3染色，观察CD3+表达情况。采用OCT包埋做冰冻切片，经丙酮固定、抗体孵育、DAB显色，观察CD11c+的表达情况。依照TRIzoI试剂要求提取组织mRNA，采用实时荧光定量PCR法检测IL-23水平。

1.5.2 体外细胞实验[4]通过酶联免疫法对DCs细胞 IL-23、IL-1β、IL-12p40 mRNA 进行检测，收集各组细胞，按TRIzoI试剂说明书提取细胞mRNA，采用RT-PCR法检测。

1.6 统计学方法 采用GraphPad Prism 6及SPSS 17.0版本进行统计分析。计量数据以均数±标准差表示，2组间对比采用t检验，多组间对比采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠皮损炎性细胞浸润检测结果 通过对小鼠皮损中IL-23、CD11c+及CD3+表达水平进行检测。CD3表达水平中，较Con组，IMQ组小鼠真皮层褐色沉淀颗粒CD3+明显增多（P＜0.01），与IMQ组相比，各治疗组小鼠皮损真皮层中CD3阳性细胞的浸润数量均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与MTX组相比，丹皮酚3个剂量组小鼠皮损中CD3阳性细胞数量接近，差异无统计学意义（P＞0.05），说明PH剂量各组CD3+表达水平相似，且与MTX组表达水平相似，见图1。

CDllc+细胞浸润情况，与IMQ组相比，各治疗组小鼠皮损中CD11c+细胞浸润数量明显下降（P＜0.05）：①Con组vs.IMQ组，=10.1516，=0.0000；②MTX组vs.IMQ 组，=3.7144，=0.0002；③PL组vs.IMQ组，=2.5677，=0.0258；④PM 组vs.IMQ 组，=3.9844，=0.0009；⑤PH组vs.IMQ组，=5.933 9，=0.000 0；与MTX组相比，PM组小鼠皮损中CD11c+细胞数量与MTX组相近，差异无统计学意义（P＞0.05），=0.110 5，=0.913 2；而PH组与MTX组对比差异有统计学意义（P＜0.05），=2.2225，=0.0393；提示PH组降低小鼠真皮中CD11c+的作用明显优于PM组，见图2。IL-23细胞因子表达水平方面，与CD11c+存在一致性，提示PH组降低小鼠真皮中IL-23作用最优（P<0.05）。见表1。

表1 各组小鼠皮损中IL-23、CD11c+及CD3+表达结果

2.2 丹皮酚体外BMDCs细胞IL-23、IL-1β、IL-12 p40mRNA表达的影响 统计结果所示，IL-23、IL-1β、IL-12p40 mRNA表达明显增加，加入丹皮酚后，直接作用BMDCs细胞，IL-23 mRNA表达均明显降低（P＜0．05），而对 IL-1β、IL-12p40 mRNA 的影响无差异（P>0.05）。丹皮酚加入浓度间差异对IL-23 mRNA 表达无统计学意义（P＞0．05），说明丹皮酚作用于BMDCs细胞可抑制细胞IL-23 mRNA的表达。见图3。

3 讨论

银屑病近年在我国患病率逐步攀升，究其根本是一种自身免疫性疾病[10]。近几年的学术研究指出，树突状细胞（DCs）的异常活化与这一自身病理免疫反应最为相关。DCs作为体内监视细胞，通过分泌多种免疫因子启动并调节机体先天固有或后天获得性的免疫应答，其在真皮层很可能负责炎症浸润与银屑病的发生[11]。

丹皮作为凉血热之要药[12]，其干燥根皮中提取出来的小分子化合物丹皮酚是丹皮发挥抗炎作用的有效成分。但鉴于丹皮酚对银屑病治疗疗效临床和科研类型研究报告均存在空白，故本实验旨在探究丹皮酚对银屑病的治疗，为进一步的研究提供参考。

图1 小鼠皮损样本免疫组化中CD3+的表达水平

图2 小鼠皮损样本免疫组化中CD11c+的表达水平

图3 BMDCs细胞IL-23、IL-1β、IL-12p40 mRNA检测结果

研究结果表明，皮损组织CD3+表达水平方面，丹皮酚各剂量之间差异无统计学意义，与MTX组效果一致。皮损组织IL-23表达水平方面，高剂量效果最显著（P<0.05）。体外实验中，丹皮酚直接作用于 BMDCs，IL-23 mRNA 表达明显降低（P＜0．05），而对IL-1β、IL-12p40 mRNA的影响差异无统计学意义（P>0.05）。本次研究中，丹皮酚可有效减轻咪喹莫特诱导的银屑病局部皮损，作用机制可通过减弱IL-23 mRNA表达，抑制了树突细胞的成熟和活化，最终减轻了银屑病的皮肤损伤。这与相关研究结论存在一致性[9]，银屑病患者局部皮损及外周血中IL-23含量较高，临床针对IL-23采取的单抗治疗也有显著疗效，丹皮酚的此次研究可为银屑病的治疗靶点明确提供了新研究方向。但本次研究涉及到的细胞免疫因子较少，未涉及细胞传导通路的研究，存在局限性，仍需进一步深入研究。