异甘草素减轻小鼠离体心脏缺血再灌注损伤

刘 敬,石晓冰,张一鸣,郝雪言,何 杰,马成俊,李 忌,王振华

(烟台大学生命科学学院/线粒体与健康衰老研究中心,山东 烟台 264005)

冠心病是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因之一.治疗手段主要有药物、经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术等[1],各种血运重建手段通过及时有效地恢复心肌血液灌注,可以减轻缺血导致的心肌损伤及坏死.然而,心肌缺血后恢复血液再灌注本身也可进一步导致心肌细胞损伤甚至坏死,这一现象被称为心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusi-on,I/R)损伤[2].

心肌I/R损伤会破坏线粒体稳态平衡引起功能紊乱,如线粒体 ATP 合成减少、ROS生成增加、Ca2+超载、膜通透性增加、线粒体片段化等[3-5],这些事件相互作用从多条途径参与 I/R过程,是心肌I/R损伤的重要原因.I/R破坏线粒体稳态平衡进而引起结构和功能的改变是导致I/R损伤的关键因素,研究和阐明线粒体参与I/R损伤的机制,对心肌I/R损伤线粒体保护新途径的发现和减轻I/R损伤,改善心梗患者的预后具有重要意义[6].

药用植物中富含的黄酮类化合物具有广泛药理活性,临床用于改善血液循环,降低血脂和胆固醇,防治高血压、冠心病、心绞痛等多种心脑血管疾病,还具有止咳、祛痰、平喘、抗菌、护肝等功效[7],诸多临床功效均与其抗氧化作用有关.异甘草素是药食同源植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)中所含的一种异黄酮类化合物,近年来,国内外学者发现其具有抗肿瘤、抗氧化、解痉、抗心律失常等广泛药理活性[8].冯斯婷等人研究了异甘草素对豚鼠心室肌细胞L型钙通道的影响,认为这些可能是异甘草素对抗心律失常作用的机制[9].CHIN Y W等报道了在甘草根和茎的过氧亚硝酸根抗氧化试验中异甘草素是最有潜力的抗氧化成分[10].

甘草为中药上品,具有补脾益气,清热解毒,祛痰止咳,缓急止痛,调和诸药等功效.经典方剂炙甘草汤,又名复脉汤,临床常用于治疗功能性心律不齐、冠心病等心血管疾病[11].已有研究表明甘草查尔酮B、C、D均对心肌I/R损伤有保护作用[12-14],但未见异甘草素对心肌I/R损伤影响的报道.本文旨在探究异甘草素对心肌I/R损伤的改善作用并初步探讨其作用机制,为甘草用于心肌I/R损伤的治疗提供实验依据.

1 材 料

1.1 实验动物

健康雄性SPF级昆明小鼠,体重30 ± 5 g,由济南朋悦实验动物研究中心提供,合格证号:SCXK (新) 2009-00101.将小鼠置于可自由饮水和饮食的12 h光照/12 h黑暗的适宜温湿度环境中,所有动物操作均遵守实验准则.

1.2 仪器与设备

Radnoti离体心脏灌流装置(美国Radnoti公司);4S AD Instruments 多道生理仪(澳大利亚Powerlab);流式细胞仪(艾森生物);匀浆机(华利精工);AR-2140 型万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);HC-3018R型高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司);HHS-1 精密恒温水浴锅(金坛市医疗器械厂).

1.3 材料与试剂

异甘草素(纯度>99%,成都曼思特生物科技有限公司,批号:14022603);水合氯醛(上海山浦化工有限公司,批号:20150236);JC-1荧光探针(sigma);ATP试剂盒(南京建成生物工程研究所);其他试剂均为国产分析纯.

2 方 法

2.1 制备小鼠离体全心缺血再灌注损伤模型

采用Langendorff逆向灌流装置建立小鼠离体心肌I/R损伤模型．取小鼠称重,腹腔注射3%的水合氯醛麻醉剂.待小鼠完全麻醉后,迅速开胸取出心脏,置于5% CO2和95% O2混合气充分饱和的冰浴K-H溶液(NaCl 119.0 mmol/L,NaHCO322.0 mmol/L,KCl 4.7 mmol/L,MgSO41.2 mmol/L,KH2PO41.2 mmol/L,Glucose 11.0 mmol/L,CaCl2·2H2O 2.5 mmol/L, Na-pyruvate 2.0 mmol/L,EDTA 0.5 mmol/L,pH 7.4)中,并迅速将心脏固定于Langendorff装置上,灌流压力76 mmHg,打开灌流阀让K-H缓冲液缓慢的进行恒压逆行灌流,使心脏在短时间内恢复跳动.剪开左心耳,球囊从左心耳插入左心室,球囊内压调至8～10 mmHg.球囊导管连接压力换能器,与4S AD Instruments生物多导记录仪相连.通过生物记录仪连续进行监测,记录如下指标:心率(HR)、左心室舒张压(LVEDP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室发展压(LVDP=LVSP-LVEDP),Chart 5软件自动记录分析左心室压力最大下降速率(±dp/dt)、左心室压力最大上升速率(+dp/dt)以及左心室做功(RPP=HR×LVDP).

2.2 实验动物分组

将小鼠随机分为3组:正常对照组(Control),模型组(I/R)和 异甘草素预处理组(ISL),ISL剂量是根据前期预实验设定,异甘草素终浓度为30 μmol/L．正常对照组:不停灌,一直灌注KH液110 min.模型组:平衡灌注35 min,停灌30 min,再灌注45 min.ISL预处理组:灌注20 min后开始灌注含药KH液15 min,停灌30 min,再灌注45 min.灌注结束后,将小鼠心脏快速取下,于-80 ℃冷冻保存,以备进行后续实验.

2.3 心肌线粒体分离

采用差速离心法提取心肌线粒体.将小鼠心脏取下置于冰浴的分离缓冲液(蔗糖 300 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,EDTA 0.2 mmol/L,pH值7.4)中,将心脏组织剪碎,用匀浆机将组织进行匀浆.将匀浆后的混悬液进行差速离心,先700×g离心10 min,取离心后的上清液在7 000×g下离心10 min, 用缓冲液重悬线粒体沉淀,再次以7 000×g离心10 min.最后得到的线粒体用测定缓冲液(KCl 125 mmol/L,HEPES 20 mmol/L,MgCl23 mmol/L,EGTA 400 μmol/L,DTT 300 μmol/L,KH2PO45 mmol/L,pH值7.2)稀释备用.线粒体浓度根据BCA蛋白定量方法确定.心肌线粒体提取全过程必须在低温下进行.

2.4 离体线粒体膜电势测定

分离得到的心肌线粒体用测定缓冲液稀释10倍,加入JC-1荧光染料,终浓度为5 μmol/L,37 ℃避光孵育10 min,用流式细胞仪进行测定线粒体膜电势.

2.5 心肌组织ATP含量测定

取灌流后的心肌组织,将心肌组织制成10 %匀浆,匀浆离心后取上清,然后按照南京建成的ATP 试剂盒说明中操作进行测定各实验组心脏组织中ATP含量.

2.6 统计方法

3 结 果

3.1 ISL促进I/R损伤小鼠心脏功能恢复

结果如表1,停灌前给予ISL 30 μmmol/L预处理15 min后,可明显上调LVDP、RPP和+dp/dt,下调-dp/dt(P<0.01);停灌30 min,恢复灌流后25 min,与停灌前相比,I/R对照组LVDP、RPP和± dp/dt均明显受损(P<0.01),ISL处理组LVDP、RPP和± dp/dt均显著高于I/R对照组(P<0.01),说明ISL预处理可显著增强心脏功能,促进离体心脏I/R损伤后功能恢复.

表1 ISL预处理小鼠离体心脏缺血再灌注损伤后心功能的影响Tab.1 Effects of ISL pretreatment on the cardiac function after ischemia/reperfusion injury in isolated mouse heart

3.2 ISL抑制I/R损伤致心肌线粒体膜电势降低

正常的线粒体膜电位是维持线粒体进行氧化磷酸化、产生三磷酸腺苷的先决条件,线粒体膜电位的稳定有利于维持细胞的正常生理功能[15-16].本实验通过对3个不同实验组的小鼠心脏线粒体进行膜电势检测,如图1数据表明,模型组较对照组线粒体膜电势显著降低(P<0.01),ISL处理组较模型组线粒体膜电势有明显的升高趋势(P<0.05),充分说明ISL对线粒体有保护作用,可以减轻心肌细胞的损伤,有利于维持心肌细胞的完整性.

I/R组与对照组比较,**P < 0.01;ISL组与I/R组比较,#P<0.05.

3.3 心肌组织ATP含量

细胞各种需能过程所消耗的ATP有95%为线性体所提供,因此线粒体与细胞维持正常功能密切相关[17],通过测定心肌组织ATP含量来考察心肌损伤与线粒体之间的关系．如图2所示,与对照组相比,I/R模型组心肌组织中 ATP的含量显著降低(P<0.01);而给予ISL处理后,心肌组织中ATP含量较模型组明显升高(P<0.05),表明 ISL可以保护线粒体,促进ATP生成,进而为心肌组织提供能量来减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤.

I/R组与对照组比较,**P<0.01,*P<0.05;ISL组与I/R组比较,#P<0.05.

图2ISL对小鼠心脏缺血再灌注后ATP生成的影响
Fig.2 Effect of ISL on ATP production after ischemia/reperfu-sioninjury in isolated mouse heart

4 结 论

心肌I/R损伤可引起心肌代谢功能紊乱,并导致细胞严重受损甚至死亡,大量研究证明,在再灌注损伤过程中,线粒体功能障碍是一个非常重要的病理机制[18-19].为了研究验证ISL对离体心肌缺血再灌注损伤的确切保护作用机制,本文通过建立改良的Langendorff逆行恒压灌流装置,确立了稳定的小鼠离体心脏I/R损伤模型,以此研究ISL对小鼠离体心脏I/R损伤后心功能及心肌线粒体的影响.

实验结果表明ISL处理组I/R后小鼠心脏动力学指标恢复明显优于对照组,说明ISL可以减轻心肌I/R损伤,增强心肌收缩能力.同时对离体心肌线粒体膜电势和心肌组织ATP含量测定的实验中发现心肌缺血/再灌注损伤会破坏线粒体稳态平衡引起功能紊乱,ISL可以保护线粒体免受损伤,促进ATP生成．综上所述,ISL具有维持线粒体结构功能完整性和保护心肌的功能.本研究为临床应用异甘草素治疗心脏I/R损伤提供了理论依据,为进一步研究奠定了基础.