海洋沉积物来源哈茨木霉R5-1萜类化合物的分离鉴定与抗弧菌活性研究

马新玥,赵 业,梁小蕊,季乃云

(1.烟台大学海洋学院,山东 烟台 264005;2.中国科学院烟台海岸带研究所,山东 烟台 264003;3.海军航空工程学院,山东 烟台 264001)

木霉属真菌是自然界中分布较为广泛的真菌类群,近年来因其良好的生物防治潜力和丰富的次级代谢产物而受到广泛关注[1]．海洋生境木霉主要来源于海洋动物、植物、沉积物等,其次生代谢产物研究始于20世纪90年代．据报道海洋沉积物来源的真菌中抗细菌、抗病毒、抗细胞毒等活性物质的化合物类型有肽类、聚酮类、生物碱、萜类等[2-5]．本实验以哈茨木霉为研究对象,该种木霉的部分菌株具有重要的生物防治作用[6],含有萜类化合物种类繁多、结构多样,并具有重要的生理、药理作用[7]．对其进行大规模发酵分离鉴定得到5个萜类化合物．作者选取水产养殖业中危害巨大的灿烂弧菌 (Vibriosplendidus)、哈维氏弧菌 (Vibrioharveyi)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)3种弧菌进行抑菌活性检测, 其中化合物I和V对鳗弧菌显示出了较好的抑制作用．

1 实 验

1.1材料、试剂与仪器

有机溶剂(甲醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯),上海国药集团化学试剂有限公司;Sephadex LH-20 凝胶,瑞典乌普萨拉 GE Healthcare公司;200～300目硅胶粉、GF-254 硅胶板,青岛海洋化工有限公司; Bruker Avance III 500型超导核磁共振波谱仪 (TMS为内标),美国 Bruker 公司;2216E液体培养基,青岛高科园海博生物技术有限公司;供试弧菌由中国科学院烟台海岸带研究所生态毒理实验室提供．

1.2方法

1.2.1 菌株分离 从渤海湾R5站位(N 38°30'22", E 120°45'30")采集回沉积物泥样约100 g置于灭菌海水中,待沉积物颗粒完全沉降后,吸取200 μL上清液,涂布在土豆培养基平板上,25 ℃恒温培养得到一株哈茨木霉R5-1．

土豆培养基:土豆200 g/L,葡萄糖20 g/L,甘露醇6.63 g/L,蔗糖6.63 g/L,味精3 g/L,CaBr20.3 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母浸粉5 g/L．海水配置,pH值8.0～8.5之间．

1.2.2 菌种鉴定及保藏 通过结合生物形态学以及遗传学ITS基因测序综合判断,菌株R5鉴定为哈茨木霉Trichodermaharzianum[8]．该菌种由中国科学院烟台海岸带研究所海洋天然产物与药物化学实验室分得,现保藏在中国科学院烟台海岸带研究所．

1.2.3 菌株的发酵及其产物的分离与纯化 将保种好的R5-1菌株接种在上述土豆固体培养基上进行活化,约接种20个左右的平板培养基28 ℃培养1～3 d;待菌株铺满整个平板后将平板培养基切至4～8块分别置于1 000 mL的锥形瓶中加入300 mL液体土豆培养基中进行发酵培养．本实验发酵培养了共100瓶,共计30 L发酵培养液．

粗提物的提取:将发酵好菌株加入乙酸乙酯杀菌、过滤．菌液用乙酸乙酯萃取,减压浓缩得到菌液提取物．菌丝体风干,粉碎,用二氯甲烷-甲醇(1∶1)提取3次得到菌丝体提取物．将两者合并得到10.8 g总粗提物．将得到的粗提物进行硅胶柱层析进行分离,用石油醚-乙酸乙酯体系梯度洗脱得14个组分(Fr. 1—Fr. 14),其中Fr. 6 (石油醚-乙酸乙酯2∶1)组分经反相硅胶柱层析(甲醇-水4∶3)得到化合物I(14.8 mg)．甲醇相得到Fr. 6-1组分,再经反相柱层析(甲醇-水)、硅胶柱层析(石油醚-乙酸乙酯1∶1)得到化合物II(3.6 mg)和III(7.2 mg)． Fr. 7 (石油醚-乙酸乙酯1∶1)组分经制备薄层层析(二氯甲烷∶甲醇15∶1)得到化合物IV(2.0 mg)和V(2.1 mg)．

1.2.4 化合物结构鉴定 运用1H NMR、13C NMR等波谱技术手段,以及对比参考文献数据,对所得化合物的结构进行鉴定．

1.2.5 化合物抑菌活性测试 抗细菌活性测试采用纸片扩散法．供试菌株:灿烂弧菌(Vibriosplendidus)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)和鳗弧菌(Vibrioanguillarum),阳性对照:氯霉素．

将保种的细菌活化后接种于2216E固体培养基上,37 ℃培养12 h后,用接种环挑取少量菌落进行液体培养,12 h后用无菌枪头吸取约200 μL细菌悬液加入提前准备好的2216E固体培养基中,涂布均匀．将配好的化合物(4 mg/mL)吸取5 μL加到滤纸片上,放置于涂布好的平板中,正面向上置于37 ℃培养12 h[9],用刻度尺量出抑菌圈直径并记录．

2 结果与讨论

2.1化合物I—V波谱数据化合物I:无色油状;C20H34O2;1H NMR谱数据(500 MHz, CDCl3):δH4.17 (1H, dd, 10.0 Hz, 3.8Hz, H-8),δH2.61 (1H, dt, 19.8 Hz, 6.2Hz, H-7a),δH1.17 (3H, s, H-12),δH1.13 (3H, s, H-16),δH1.17 (3H, d, 7.1Hz, H-13),δH0.97 (3H, s, H-15),δH0.90 (3H, s, H-14)．13C NMR谱数据 (125 MHz):δC73.8 (C-3, C),δC72.7 (C-8, CH),δC51.6 (C-9, CH),δC52.1 (C-10b, CH),δC43.3 (C-2a, CH),δC43.4 (C-1, CH2),δC41.0 (C-7, CH2),δC40.2 (C-10, CH2),δC40.1 (C-4, CH2),δC38.4 (C-10a, C),δC38.3 (C-11, C),δC37.0 (C-5a, C),δC25.6 (C-6, CH),δC27.2 (C-5, CH2),δC26.1 (C-15, CH3),δC25.8 (C-16, CH3),δC22.9 (C-13, CH3),δC21.2 (C-2, CH2),δC20.5 (C-12, CH3),δC18.8 (C-14, CH3)．经文献对比,化合物I的1H和13C NMR显示与化合物wickerol B[10]的数据一致．

化合物II:无色油状;C15H24O2;1H NMR谱数据(500 MHz, CDCl3):δH6.85(1H, dd, 4.7 Hz, 3.5 Hz, H-9),δH4.25 (2H, brs, H-15),δH2.75 (1H, dt, 20.5 Hz, 1.6 Hz, H-10a),δH2.39, 2.32 (2H, d, 16.9 Hz, 17.5 Hz, H-6),δH2.21 (1H, dd, 21.1 Hz, 4.9 Hz, H-10b),δH1.71(3H, m,H-2/3/4),δH1.62 (1H, m, H-11),δH1.38 (2H, m, H-1/2),δH0.98 (3H, d, 6.7 Hz, H-14),δH0.86 (3H, d, 8.5 Hz, H-12),δH0.85 (3H, d, 8.4 Hz, H-13)．13C NMR谱数据 (125 MHz):δC201.7 (C-7, C),δC146.4 (C-9, CH2),δC137.5 (C-8, C),δC62.3 (C-15, CH2),δC60.0 (C-1, CH),δC47.9 (C-5, C),δC47.6 (C-4, CH),δC39.0 (C-6, CH2),δC37.5 (C-10, CH2),δC30.0 (C-3, CH2),δC29.3 (C-11, CH),δC25.7 (C-2, CH2),δC24.2 (C-13, CH3),δC21.8 (C-13, CH3),δC16.5 (C-14, CH3)．经文献对比,化合物II的1H和13C NMR显示与化合物15-hydroxyacorenone ((1S,4S,5S)-8-hydroxymethyl-1-isopro pyl-4-Methylspiro[4.5]dec-8-en-7-o ne)[11]的数据一致．

化合物III:无色油状;C15H28O2;1H NMR谱数据(500 MHz, CDCl3):δH5.10 (1H, dt, 7.1Hz, 1.2Hz, H-10),δH2.03 (1H, m, H-9),δH1.83 (1H, m, H-6),δH1.66 (3H, s, H-12),δH1.60 (3H, s, H-15),δH1.48 (2H, t, H-8),δH1.23 (3H, s, H-13),δH1.14 (3H, s, H-14),δH1.01 (3H, d, 6.9Hz, H-1)．13C NMR谱数据 (125 MHz):δC130.8 (C-11, C),δC123.5 (C-10, CH),δC80.3 (C-3, C),δC73.9 (C-7, C),δC53.3 (C-6, CH),δC43.2 (C-2, CH),δC39.4 (C-8, CH2),δC41.4 (C-4, CH2),δC27.1 (C-13, CH3),δC24.8 (C-12, CH3),δC27.0 (C-5, CH2),δC23.3 (C-14, CH3),δC23.7 (C-9, CH2),δC16.7 (C-15, CH3),δC13.5 (C-1, CH3)．经文献对比,化合物III的1H和13C NMR显示与化合物cyclonerodi[12]的数据一致．

化合物IV:无色油状;C15H29O3;1H NMR谱数据(500 MHz, CDCl3):δH3.58 (1H, m, H-10),δH1.16 (3H, s, H-13),δH1.31 (3H, s, H-12/15),δH1.08 (3H, s, H-14),δH1.12 (3H, s, H-12/15),δH1.06 (3H, d, 6.8 Hz, H-1)．13C NMR谱数据 (125 MHz):δC86.7 (C-10, CH),δC86.5 (C-7, C),δC81.3 (C-3, C),δC70.6 (C-11, C),δC54.9 (C-6, CH),δC45.3 (C-2, CH),δC40.7 (C-6, CH2),δC36.9 (C-8, CH2),δC27.7 (C-12/15, CH3),δC27.8 (C-13, CH3),δC26.0 (C-9, CH2),δC26.1 (C-14, CH3),δC24.5 (C-5, CH2),δC29.2 (C-12/15, CH3),δC12.7 (C-1, CH3)．经文献对比,化合物IV的1H和13C NMR显示与化合物epicycloneodiol oxide[13]的数据一致．

化合物V:无色油状;C15H29O3;1H NMR谱数据(500 MHz, CDCl3):δH3.65(1H, t, 7.3 Hz, H-10),δH1.75 (3H, s, H-13),δH1.11 (3H, s, H-12/15),δH1.12 (3H, s, H-14),δH1.03 (3H, s, H-12/15),δH1.13 (3H, d, 6.8 Hz, H-1)．13C NMR谱数据 (125 MHz):δC84.8 (C-7, C),δC81.5 (C-10, CH),δC80.2 (C-3, C),δC71.4 (C-11, C),δC57.9 (C-6, CH),δC45.8 (C-2, CH),δC40.7 (C-6, CH2),δC35.1 (C-8, CH2),δC26.3 (C-12/15, CH3),δC27.1 (C-9, CH2),δC27.3 (C-14, CH3),δC24.7 (C-13, CH2),δC22.5 (C-5, CH3),δC26.2 (C-12/15, CH3),δC13.9 (C-1, CH3)．经文献对比,化合物V的1H和13C NMR显示与化合物cycloneodiol oxide[13]的数据一致．

根据波谱数据,确定化合物I—V的化学结构如图1所示．

图1 化合物I—V的结构式Fig.1 Structures of compounds I-V

2.2化合物抗弧菌生物活性测定结果

抗细菌活性如表1所示,对分离得到的化合物I—V进行了抗弧菌活性测试,在测试了3株弧菌:灿烂弧菌(Vibriosplendidus)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)和鳗弧菌(Vibrioanguillarum)后,测试结果显示,化合物I—V(20 μg/片)均对鳗弧菌表现出了不同程度的抗菌活性,对哈维氏弧菌与鳗弧菌并无抑制作用,化合物I和V对鳗弧菌的抑制作用尤为明显,其中化合物I抗鳗弧菌滤纸片抑菌圈直径为11.4 mm,化合物V抗鳗弧菌滤纸片抑菌圈直径为10.3 mm．

表1 化合物I—V的抗弧菌活性结果(4 mg/mL)Tab.1 Antibacterial Activities of Compounds I-V (4 mg/mL) mm

3 讨 论

从采集自渤海沉积物样品中分离得到一株海洋真菌哈茨木霉R5-1,对其扩大发酵结合硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、反相硅胶柱层析、制备薄层层析等分离手段分离得到5个萜类化合物wickerol B (I)、15-hydroxy acorenone ((1S,4S,5S)-8-hydroxymethyl-1-isopropyl-4-hethylspiro[4.5]dec-8-en-7-one) (II)、cyclonerodi (III)、epicycloneodiol oxide (IV) 和cycloneodiol oxide (V)．本文中分离所得化合物I—V状态均为油状,而参考文献中报道化合物II[11]为无定形固体结构,化合物V[13]为针状固体结构与文中描述状态有偏差,特此说明:由于在化合物的分离过程中化合物分离出时的温度的不同、去除溶剂的方法不同,如自然状态下晾干、用旋转蒸发仪蒸干均会引起最终化合物的状态呈现不同,故通过核磁共振图谱及对比文献数据确定其结构．

弧菌一直为水产养殖中的主要致病菌来源,每年有大部分养殖产业深受其害,如在水产养殖过程中有一条仔鱼感染将会迅速蔓延至整个鱼塘,造成不可估量的经济和资源损失．萜类化合物在天然产物领域中一直扮演着具有良好生理活性的化合物结构类型的角色[14],具有抗寄生虫、抗肿瘤、抗细菌、抗各种酶等活性,其中也不乏被用来作为海洋药物的先导化合物用于实际产业应用．化合物I—V对抗海洋来源弧菌的活性测试结果显示,5个化合物均显示出对鳗弧菌有抑制作用,其中化合物I和V显示出了较好的活性．此研究丰富了萜类化合物抗弧菌活性的研究,也为抗弧菌海洋药物研发做出了初步探索,以期为将来进一步研究提供导示作用．