毛蕊异黄酮抑制压力超负荷大鼠心肌肥厚及对JAK∕STAT 信号通路的影响

黄璟 成传访 李惠波 罗燕华 区文超

广州医科大学附属第二医院1心内科（广州心血管疾病研究所），2 超声科（广州510260）

心肌肥厚是机体对生理和病理状态的适应反应，结果导致心室重构。许多研究已经证实心室重构是引起心血管疾病发生率和死亡率显著升高的独立危险因素［1-2］。因此防治心肌肥厚进展到心室重构具有重要意义［3］。近年来发现酪氨酸激酶∕信号转导子和转录激活子（janus kinase∕signal transducer and activator of transcription，JAK∕STAT）信号通路在心肌肥厚的发生发展中起着重要的作用，它是压力负荷激活心肌肥厚的主要信号通路［4-6］。目前临床上治疗心肌肥厚的药物有限、效果不佳，不良反应较多。传统中医药为天然成分，具有副作用低、安全、多效的特点，可和西医治疗有机结合［7］。而现今传统中药多是配方制剂，成分复杂，作用靶点并不明确，难以标准化和国际化。因此寻找高纯度、安全、有效的中药单体逆转心肌肥厚，成为目前国内中医药研究的一大课题。毛蕊异黄酮是从传统中药黄芪中提取分离得到的一种主要单体成分，是黄芪提取物的主要有效生物化学成分之一，在心肌肥厚中的作用尚不明确。本研究探讨了毛蕊异黄酮在压力负荷大鼠心肌肥厚中的作用，以及对JAK∕STAT 信号通路的影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物 SPF 级SD 大鼠由广东省医学实验动物中心提供，共24 只，雌雄各半，体质量180～220 g。

1.2 实验材料与试剂 毛蕊异黄酮及DMSO 溶剂（sigma 公司），JAK1、STAT3、β-actin 一抗（CST 公司）。

1.3 分组与处理 大鼠随机分为腹主动脉缩窄组（TAAC组），TAAC+溶剂对照组（vehicle组）以及TAAC+毛蕊异黄酮处理组（calycosin组），术后1 周开始腹腔给药。vehicle组及calycosin组每天分别给予等量溶剂或毛蕊异黄酮［1 mg∕（kg·d），n= 8］。8 周后行超声心动图、左室有创压检查，取心脏组织行Western Blot 检测JAK1、STAT3 蛋白表达量。

1.4 腹主动脉缩窄压力超负荷心肌肥厚模型制备（TAAC 术） SD 大鼠称重后腹腔注射10%水合氯醛200～300 mg∕kg 麻醉后固定，医用酒精消毒皮肤，纵行开腹，于左肾动脉上方钝性分离腹主动脉，沿血管走行方向放置直径0.6 mm 钝性钢丝与腹主动脉一起结扎后迅速抽出针头，使腹主动脉形成固定缩窄，关腹。术后3 d 内予腹腔注射青霉素（18 000 U∕kg）预防感染。

1.5 超声心动图检查 大鼠称重后，10%水合氯醛麻醉（200～300 mg∕kg，腹腔注射），剔除大鼠胸部毛发。以Philips iE33 超声诊断仪行超声心动图检查。L15-7io术中探头，左心室横切面分别测量室间隔厚度（IVS）、左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室后壁厚度（LVPW）、左心室收缩末期内径（LVESD）、左心室舒张末期容积（LVEDV）、左心室收缩末期容积（LVESV），并计算左心室射血分数（LVEF）。

1.6 左心室有创压检测 大鼠称重后，10%水合氯醛麻醉（200～300 mg∕kg，腹腔注射），切开颈部皮肤并暴露右颈动脉，PE50 导管行右颈动脉插管至左心室，Powerlab 数据采集分析系统（ADIn-struments，澳大利亚）记录心室压力波形，Labchart Pro（AD-Instruments，澳大利亚）分析左心室收缩末压（LVSP）、舒张末压（LVEDP）及心室内压最大上升或下降速率（±dp∕dt max）。

1.7 左心室质量指数（LVMI）测定 电子天平测量空腹大鼠体质量，左心室测压完成后处死大鼠后分离出左心室，滤纸吸干水分后电子天平称重，计算大鼠LVMI=左心室质量（mg）∕体质量（g）。

1.8 心脏组织JAK1 及STAT3 蛋白表达的检测取100 mg 心脏组织，加入少量液氮快速研磨后，加入蛋白裂解液，冰浴裂解20 min，14 000g，4 ℃离心20 min，取上清，BCA 法蛋白定量。制胶，上样，电泳后冰上转膜，洗膜后10%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入相应一抗（1∶1 000 稀释），4 ℃孵育过夜，洗膜后加入ECL 发光底物，暗室压片曝光。内参蛋白为β-actin。Image-Pro Plus 6.0 软件分析蛋白灰度。

1.9 统计学方法 使用SPSS 18.0 进行统计分析研究数据以均数±标准差表示，两样本均数的比较采用独立样本t检验，多组样本均数的比较采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠超声心动图参数 TAAC 术大鼠压力超负荷造模成功，腹腔连续给药8 周后，与TAAC组及vehicle组相比较，Calycosin组大鼠IVS、LVPW明显减小（P＜0.01），LVEDD 及LVESV 均明显增大（P＜0.05），LVEDV 明显增加（P＜0.01）；与TAAC组及vehicle组相比较，Calycosin组大鼠LVESD 有增大，但差异无统计学意义（P＞0.05）；各组大鼠LVEF 差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 大鼠超声心动图参数比较Tab.1 Comparison of echocardiographic parameters in rats±s

表1 大鼠超声心动图参数比较Tab.1 Comparison of echocardiographic parameters in rats±s

组别TAAC组Vehicle组Calycosin组IVS（cm）0.195±0.013 0.189±0.011 0.158±0.009#LVEDD（cm）0.521±0.038 0.551±0.023 0.625±0.090*LVPW（cm）0.223±0.022 0.201±0.026 0.169±0.027#LVESD（cm）0.231±0.047 0.228±0.041 0.241±0.026 LVEDV（mL）0.371±0.063 0.383±0.057 0.581±0.027#LVESV（mL）0.047±0.031 0.053±0.028 0.081±0.018*LVEF（%）89.4±3.6 88.3±3.2 86.1±4.7

2.2 LVMI 的变化 与TAAC组及vehicle组比较，Calycosin组LVMI 显著降低（P＜0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠左心室有创压比较 与TAAC组及vehicle组比较，Calycosin组大鼠左心室舒张末压无明显改变（P＞0.05），左心室收缩末压明显下降（P＜0.05），±dp∕dt max 值明显升高（P＜0.05）。见表3。

2.4 各组大鼠心脏组织JAK1、STAT3 蛋白表达情况 腹腔给药8 周后，处死大鼠，取出心脏组织，WB 检测提示，与TAAC组及vehicle组比较，Calycosin组大鼠心肌组织JAK1 及STAT3 蛋白表达量明显降低（P＜0.05）。见图1。

表2 大鼠LVMI 的变化Tab.2 Changes of left ventricular mass index（LVMI）in rats ±s

表2 大鼠LVMI 的变化Tab.2 Changes of left ventricular mass index（LVMI）in rats ±s

注：*与TAAC组及vehicle组比较，Calycosin组LVMI 显著降低（P＜0.05）

组别TAAC组Vehicle组Calycosin组LVMI（mg∕g）2.45±0.16 2.38±0.18 2.21±0.21*

表3 大鼠左心室有创压比较Tab.3 Comparison of left ventricular invasive pressure in rats±s

表3 大鼠左心室有创压比较Tab.3 Comparison of left ventricular invasive pressure in rats±s

注：与TAAC组及vehicle组比较，*P＜0.05

组别TAAC组Vehicle组Calycosin组LVEDP（mmHg）2.97±1.86 3.52±1.91 3.15±1.79 LVSP（mmHg）151.14±6.28 149.47±7.13 136.09±8.32#+dp∕dtmax（mmHg∕s）5912±378 5984±335 6375±385*-dp∕dtmax（mmHg∕s）5459±427 5527±409 5981±411*

3 讨论

心肌肥厚是由心肌损害所引起的一系列慢性、进行性病理生理变化，它主要表现为心肌细胞的肥大、质量∕容量比增加、室壁张力指数增加和间质成分的改变，结果是心肌过度伸长，心肌细胞坏死和左室扩张、导致心室重构。心肌肥厚常常发生在高血压、缺血性心脏病和心力衰竭。它是心肌细胞对机械、神经激素和炎症因子刺激的主要反应之一，表现为心肌细胞的体积增大、蛋白合成增加和横纹肌结构的改变，并没有心肌细胞数量的增多。这种改变使心肌细胞收缩力增强，从而提高心输出量。最初心肌的肥厚是为了保持最优化的生物力学应力和正常的心脏泵功能，但是这种不正常的增生最后使心脏功能失调。最初作为心肌适应性反应的心肌肥厚，最后常常导致心室重构、心室扩大和心力衰竭甚至死亡。心肌肥厚所致心室重构已被证实是引起心血管疾病发生率和死亡率显著升高的独立危险因素。

图1 大鼠心脏组织JAK1、STAT3 蛋白表达情况Fig.1 The expression of JAK1 and STAT3 in rat heart

黄芪始载于《神农本草经》，味甘、性温，有补气升阳，固表止汗，托毒排脓，利水消肿和生肌等功效。临床研究发现黄芪对心肌缺血∕再灌注损伤及病毒感染的心肌均具有明显的保护作用，以及能改善心功能，对心力衰竭有明显的治疗效果［8-9］。多年来对单味黄芪、复方及黄芪的有效成分进行了大量的心血管药理方面的研究及探讨，发现黄芪提取物具有抑制心肌肥厚的作用，可能和其抑制炎症因子防止脂质过氧化，清除氧自由基，提高线粒体活性以及抑制细胞内钙超载等有关。有研究显示黄芪能抑制异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥厚，还能逆转压力超负荷大鼠和肾性高血压大鼠的左室肥厚。对压力超负荷大鼠黄芪能改善心功能，减轻心肌组织水肿［8-11］。黄芪提取物还可明显改善大鼠心肌梗死后异常的血液流变学指标、组织病变及胶原纤维构成比例［12］。黄芪提取物含有多种化学成分，包括有黄酮类、皂甙类、多糖类、氨基酸以及微量元素，其成分复杂，作用靶点并不明确，难以标准化和国际化。

心肌肥厚病理生理过程中，主要信号转导通路是丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、钙调蛋白依赖的磷酸酶（calmodulin-dependent phosphatase）以及JAK∕STAT信号通路［13-15］。JAK∕STAT 信号通路在近年来备受重视。许多致心肌肥厚刺激信号均能激活心肌JA K∕STA T 信号通路，如：AngII、IL-6、TNF- α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、CT-1、压力负荷等［16］。AK∕STAT信号通路在压力负荷介导的心肌肥厚中的作用机制尚未完全阐明，可能与促进ANP 基因表达、Ang II 自分泌增加相关。文献报道，TAAC 心脏肥厚大鼠模型JAK∕STAT 信号通路激活，富氢盐水抑制心肌肥厚的同时降低了JAK∕STAT 信号通路活性［17］。在本研究中，毛蕊异黄酮减轻TAAC 大鼠心脏肥厚的同时，心脏组织中JAK∕STAT 信号通路活性明显下降。

综上所述，毛蕊异黄酮作为黄芪的主要生物活性成分，也具有抑制压力超负荷大鼠的心室重构作用，其机制可能是通过降低JAK∕STAT 信号通路活性，这一发现为改善慢性心力衰竭患者心室重构提供了新的治疗思路。