高尿酸对肾小管上皮细胞HK-2增殖、凋亡的影响及其机制研究

曾宇鹏 谢席胜

1阆中市人民医院肾内科（四川阆中637400）；2南充市中心医院肾内科（四川南充637000）

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）近年来发病率逐渐升高，严重威胁人们生命健康。CKD 具有患病率高、合并心血管疾病率高和病死率高的“三高”特点，以及知晓率低、防治率低和合并心血管疾病认知率低的“三低”特点［1］。我国CKD 总患病率达10.8%，CKD 患者预计近1.2 亿，但CKD 知晓率仅为12.5%，CKD 患者最终进展为终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD），患者需终生透析治疗或者肾替代治疗。肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）是导致CKD 进展为ESRD 的主要病理改变。正常情况下，肾小管上皮细胞通过自身增殖、再生等机制自我修复肾小管损伤，并能够通过凋亡机制清除自身老化、坏死细胞，维持肾小管正常生理功能。然而病理条件下，肾小管上皮细胞过度凋亡损伤肾组织结构和正常功能，是导致RIF 进展的重要机制之一。

尿酸（uric acid，UA）是嘌呤代谢的终末产物，嘌呤代谢紊乱、能量代谢异常及肾脏对尿酸的排泄障碍均可引起血浆尿酸浓度升高或降低。肾脏是尿酸代谢的主要器官，体内尿酸70%由肾脏排泄［3］。既往研究发现高尿酸通过线粒体途径导致人肾小管上皮细胞（human renal tubular epithelial cells，HK-2）凋亡，高尿酸血症是导致CKD 进展的重要因素［4］，此外高尿酸通过内质网应激调节HK-2 细胞表型转化［5］，本研究重点探讨尿酸抑制肾小管上皮细胞增殖并促进其凋亡，尿酸激活内质网应激可能是其重要分子机制，为治疗高尿酸肾损害提供了新的线索。

1 材料与方法

1.1 材料 人肾小管上皮细胞HK-2 购买自美国ATCC 细胞库；DMED 培养基购自美国Gibco 公司，胎牛血清购自美国Hyclone 公司；尿酸和四甲基偶氮唑盐（MTT）购自美国Sigma-Aldrich 公司；4-苯基丁酸（4-PBA）购自美国Sigma-Aldrich 公司；Annexin V-FITC∕碘化丙啶双标记细胞凋亡检测试剂盒购自北京华夏远洋科技有限公司；兔抗人Caspase-3∕Cleaved-Caspase-3、Caspase-12∕Cleaved-Caspase-12、BiP∕GRP78 抗体购自美国CST 公司；兔抗人IRE-1 和JNK 单克隆抗体购自美国abcam 公司；β-ACTIN抗体购自沈阳万类生物科技有限公司。

1.2 细胞培养 人肾小管上皮细胞HK-2 接种于含10%胎牛血清和双抗溶液（青霉素100 IU∕mL 和链霉素100 IU∕mL）的DMEM 培养基中，细胞呈贴壁生长，放置在37 ℃、含5%CO2培养箱中进行常规培养，每隔2～3 d 细胞换液。当细胞生长至对数期时，用0.05%胰酶消化离心并重悬细胞，传代于新培养皿继续培养。

1.3 四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验检测细胞增殖将对数生长期的HK-2 细胞按照5 000 个∕孔接种于96 孔板，每组设置5 个复孔，37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养。待细胞贴壁后，分别加入0、50、100、150、200、250、300 mg∕L 的尿酸处理肾小管上皮细胞24 h，以及150 mg∕L 的尿酸处理肾小管上皮细胞24、48、72 h，处理后每孔加入含MTT 培养基200 μL，培养箱继续孵育4 h。吸去培养基，每孔加入150 μL DMSO，振荡器低速振荡10 min。待结晶物充分溶解，使用酶标仪490 nm 处检测各孔吸光度（OD值）。

1.4 免疫印迹法（Western blot）检测蛋白水平 将HK-2 细胞消化离心后种于6 孔板内，待细胞贴壁后，加入不同浓度的尿酸分组继续培养24 h。PBS清洗细胞3 遍，使用RIPA 裂解液裂解，提取总蛋白。采用BCA 法测定蛋白浓度，其余蛋白加入6×Loading buffer 加热变性。取变性后蛋白20 μg ∕孔加入SDS-PAGE 凝胶电泳分离，110 V 电压转移至NC膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h，TBST洗3次，每次10 min。加特定一抗4 ℃孵育过夜。次日TBST 清洗10 min × 3 次，加入辣根过氧化酶标记的相应二抗，于摇床上慢速常温孵育1 h，TBST清洗10 min× 3 次，加入ECL 显影液，使用化学发光荧光成像系统（Bio-Rad）进行蛋白显影。以β-actin 作为内参计算各组蛋白的相对表达量。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 HK-2 细胞常规培养，调整细胞密度按4.0 × 105∕孔接种于6孔板中，细胞培养至贴壁，加入150 和200 mg∕L 的尿酸分别处理HK-2 细胞24 h。PBS 清洗细胞后加入胰酶消化离心，再次使用PBS 清洗2 次，每管加入250 μL 结合缓冲液，细胞计数后调节细胞浓度为1.0 × 106∕mL，吸取100 μL 细胞悬液加入流式管，加入Annexin V-FITC（150 mg∕L）和碘化丙锭（120 mg∕L）混匀，放置于避光、室温条件下孵育15 min，加入PBS清洗细胞，使用流式细胞仪（FACS）检测细胞凋亡。

1.6 统计学方法 实验结果使用SPSS 19.0 统计软件进行分析，所得的实验数据以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 尿酸抑制肾小管上皮细胞增殖能力 使用0、50、100、150、200、250、300 mg∕L 的尿酸处理肾小管上皮细胞24 h（图1A），以及150 mg∕L 的尿酸处理肾小管上皮细胞24、48、72 h（图1B），使用MTT 实验检测肾小管上皮细胞增殖能力的变化，结果显示与对照组相比尿酸抑制肾小管上皮细胞增殖能力，并呈浓度依赖性和时间依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 尿酸促进Cleaved-Caspase-3 和Cleaved-Caspase-12 蛋白表达 实验组150 和200 mg∕L 浓度尿酸处理肾小管上皮细胞24 h，通过Western blot检 测Caspase-3∕Cleaved-Caspase-3 和Caspase-12∕Cleaved-Caspase-12 蛋白改变，与对照组相比尿酸促进HK-2 细胞（图2A 和图2B）Cleaved-Caspase 3和Cleaved-Caspase 12 蛋白表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 尿酸促进肾小管上皮细胞凋亡 使用150 和200 mg∕L 浓度尿酸处理HK-2 细胞24 h，Annexin VFITC∕PI 双染流式细胞仪测定细胞凋亡。对照组细胞凋亡率为（5.12±1.02）%，150和200 mg∕L 尿酸处理组细胞凋亡率分别为（23.69±3.62）%和（38.87±5.48）%（表1）。与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

图1 尿酸抑制肾小管上皮细胞增殖Fig.1 Uric acid inhibits the proliferation of renal tubular epithelial cells

2.4 尿酸通过IRE-1/JNK 信号通路激活内质网应激调节细胞增殖、凋亡 本研究发现尿酸抑制肾小管上皮细胞增殖并促进凋亡发生，但其分子机制未知。文献［6］报道细胞内质网应激与增殖和凋亡存在密切联系，本研究继续探究尿酸和肾小管上皮细胞内质网应激之间的关系。实验组150 mg∕L和200 mg∕L 浓度尿酸处理肾小管上皮细胞24 h，Western-blot 检测发现肾小管上皮细胞BiP∕GRP78、IRE1 和JNK 蛋白表达上调（图3A），说明尿酸激活肾小管上皮细胞内质网应激的发生。应用4-PBA（5 μmol∕L）阻断内质网应激后合用尿酸处理，与尿酸处理组（200 mg∕L）相比Cleaved-Caspase-12 蛋白水平下调（图3B），同时MTT实验发现细胞存活率升高（P= 0.004）（图3C），差异具有统计学意义（P＜0.01）。显示4-PBA 能够抑制尿酸引起的肾小管上皮细胞凋亡，尿酸通过内质网应激途径发挥功能。

3 讨论

尿酸是人体嘌呤代谢的产物，作为人体重要小分子由肾脏排出，流行病学发现长期高尿酸血症是引起慢性肾脏病的重要因素［7］。随着人们摄入富含嘌呤类或者蛋白质类食物的增加，高尿酸血症发病率呈逐年升高［8］。高尿酸形成结晶沉积在肾小管-肾间质中，通过诱发机械性损伤或者炎症反应导致肾功能损害［9］。

图2 尿酸促进Cleaved-Caspase-3 和Cleaved-Caspase-12 蛋白表达Fig.2 Uric acid promotes the protein expression of Cleaved-Caspase-3 and Cleaved-Caspase-12

表1 尿酸对肾小管上皮细胞凋亡率的影响Tab.1 Effect of uric acid on apoptosis rate of renal tubular epithelial cells ±s

注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

分组对照组150（mg∕L）尿酸200（mg∕L）尿酸凋亡率（%）5.12±1.02 23.69±3.62 38.87±5.48 P 值0.001**＜0.001***

图3 尿酸通过IRE-1∕JNK 信号通路激活内质网应激调节细胞增殖、凋亡Fig.3 Uric acid activates endoplasmic reticulum stress through IRE-1∕JNK signaling pathway to regulate cell proliferation and apoptosis

肾小管上皮细胞富含尿酸转运体，是尿酸代谢过程中的重要组成。肾小管上皮细胞凋亡增多是导致尿酸转运障碍的重要因素［10］，本研究重点探讨尿酸对肾小管上皮细胞增殖、凋亡能力的影响。不同浓度尿酸或者不同时间处理肾小管上皮细胞，MTT 实验检测细胞增殖能力发现尿酸抑制其增殖，且呈浓度依赖性和时间依赖性。同时使用Western blot 检测不同浓度尿酸处理后凋亡蛋白水平改变，尿酸促进Cleaved-Caspase-3 和Cleaved-Caspase-12 蛋白表达。此外，通过流式细胞仪检测尿酸处理后肾小管上皮细胞凋亡水平，发现尿酸促进其凋亡。高尿酸抑制肾小管上皮细胞增殖并促进其凋亡，既往文献发现尿酸可激活线粒体途径导致HK-2 细胞凋亡，加速肾脏病恶性进展，然而高尿酸引起HK-2 细胞凋亡的其他分子机制尚不清楚。内质网（endoplasmic reticulum，ER）在真核生物中普遍存在，其内环境的稳定是维持内质网正常生理功能的基本条件，但很多因素可导致内质网功能失衡，形成内质网应激（ER stress，ERs），例如缺血再灌注损伤、氧化应激、蛋白质过度错误折叠、内质网钙代谢紊乱等［11］。内质网分子伴侣蛋白GRP78∕BiP 和IRE1 是ERs 过程中重要分子，生理条件下两者结合而失活，而ERs 发生时两者分离而激活下游信号通路［12］。当ERs 长期存在时，会引起细胞凋亡。IRE1 是介导内质网应激引起细胞凋亡的关键分子，通过与合肿瘤坏死因子受体相关因子2（TNF receptor associated factor，TRAF2）和凋亡信号调节激酶（apoptosis-signaling kinase 1，ASK1）结合形成TRAF2-ASK1-JNK 复合体，激活下游JNK 信号通路引起细胞凋亡［17］。本研究通过Western-blot 检测不同浓度尿酸处理后肾小管上皮细胞BiP∕GRP78、IRE1 和JNK 蛋白改变，发现BiP∕GRP78、IRE1 和JNK 蛋白表达升高，说明尿酸激活肾小管上皮细胞内质网应激。然而尿酸是否通过激活内质网应激调节增殖和凋亡却不能确定，本实验使用4-PBA 阻断内质网应激后再使用尿酸处理，发现Cleaved-Caspase-12 蛋白水平下调，同时细胞存活率升高，证实了尿酸通过内质网应激途径发挥功能。

综上所述，尿酸抑制肾小管上皮细胞增殖并促进其凋亡，并发现尿酸通过激活内质网应激是其可能的分子机制，阻断内质网应激治疗高尿酸血症引起的慢性肾脏病具有临床应用价值，进一步深入探讨尿酸损伤肾小管上皮细胞的分子机制，将有可能为高尿酸血症的综合治疗带来新的选择。