HBV 感染人外周血单个核细胞时体外免疫效应的变化

梅清 李小鹏 吴振平 李丹 张文苑 余婷婷 张伦理

南昌大学第一附属医院感染科（南昌330006）

据世界卫生组织报道全球约20 亿人曾感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），其中2.4 亿人为慢性HBV 感染者。每年约有100 万人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝细胞癌［1］。慢性HBV 感染成为亟待解决的全球公共卫生问题。目前由于尚未完全阐明慢性HBV 感染形成的机制，所以很难实现HBV 的免疫清除。既往研究表明HBV 感染时，机体免疫系统激活，并产生一系列免疫效应，包括免疫细胞数改变、免疫细胞分泌的细胞因子的浓度变化如：干扰素-γ（interferonγ，IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），免疫细胞的细胞表面受体的阳性率发生改变：如程序性死亡受体-1（programmed death receptor-1，PD-1），而这些物质的含量皆与HBV 感染后的预后相关。外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）是由T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、自然杀伤细胞等多种免疫细胞组成的混合群体，在先天性免疫、适应性免疫中发挥着至关重要的作用［2］。近些年有大量文献［3-5］报道HBV 能感染PBMCs，其临床价值也正越来越引起重视。体外观察PBMCs 感染HBV 后出现的一系列免疫效应变化，有益于理解HBV 感染在体内发生的机制，为进一步理解慢性HBV 感染形成的机制提供帮助。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 （1）细胞：PBMC 取自10 名健康志愿者的外周静脉血（健康志愿者为近期体检排除乙肝、丙肝、艾滋、肿瘤等疾病且乙肝五项全阴的志愿者）。（2）主要试剂：RPMI 1640 培养基购于美国Hyclone 公司、胎牛血清购于德国PAN 公司；人淋巴细胞分离液购于天津TBD 公司；重组人白细胞介素2（interleukin 2，IL-2）购于美国Proteintech 公司；细胞计数试剂盒（cell counting kit，CCK8）购于美国Sigma 公司；IFN-γ ELISA 和TNF-α ELISA 检测试剂盒均购于武汉三鹰生物工程有限公司；使用的所有流式抗体均为北京达科为生物技术有限公司的Biolegend（USA）抗体，包括鼠抗人CD3-FITC、CD8-PE∕CY7、PD-1-PE 抗体和抗鼠IgGl-FITC、IgGl-PE∕CY7、IgGl-PE 同型对照抗体。

1.2 方法

1.2.1 提取和培养人PBMCs 取健康人外周静脉血80 mL，采用Ficoll 法分离PBMC，并用完全培养基（含10%胎牛血清、IL-2 200 U∕mL）调节PBMC细胞浓度至1.0×106个∕mL，接种于6 孔板中，每孔2 mL。

1.2.2 HBV 持续刺激PBMCs 在门诊收集HBV DNA 浓度为2×107IU∕mL 的免疫耐受期的HBV 感染者血清。实验分两组，分别为对照组（PBMCs）、实验组（免疫耐受期的HBV感染者血清+PBMCs），每组设置重复孔4 孔。轻混培养液使其均匀后置入CO2孵箱中培养，前6 d 每隔1 d 对对照组、实验组补充500 μL 的完全培养基，同时实验组还每隔1 d 每孔补充25 μL 的慢性HBV 感染者的血清，在第8 天时进行离心换液，以后每隔1 d 进行1 次换液，同时实验组每隔1 d 还需补充25 μL 患者血清，收集第0、2、4、6、8、12、18、24 天的实验组和对照组的上清液。

1.2.3 CCK-8 检测PBMC 增殖 参照说明书进行实验。在0、2、4、6、8 d 时，将实验组、对照组PBMC，重悬，取其中的100 μL 细胞悬液和空白组（完全培养基）100 μL 分别接种于96 孔板中，实验中每组均设3 个复孔，结果以3 孔平均值计算。向每孔加入100 μL CCK-8 试剂，然后置入37 ℃CO2孵箱中继续培养3 h，用酶标仪测定450 nm 波长时的吸光度。

1.2.4 ELISA 法检测IFN-γ和TNF-α的浓度 采用ELISA 法检测收集的（第0、2、4、6、8、12、18、24天）实验组和对照组细胞培养上清液中IFN-γ和TNF-α的浓度，参照说明书进行实验。根据酶标仪测定出的标准品的OD值绘画出标准曲线，继而再计算出IFN-γ和TNF-α的浓度。

1.2.5 流式细胞学检测CD8+T 细胞上PD-1 阳性率 提取并收集未开始刺激时实验组和对照组的PBMC，以及HBV 刺激24 d 时实验组和对照组的PBMC，离心后，用PBS 洗涤，并再次用PBS 调整细胞悬液至100 μL，加入鼠抗人CD3-FITC、CD8-PE∕CY7 及PD-1-PE 抗体，于4 ℃避光温育30 min，用PBS 洗涤2 次后在贝克曼FC500 流式仪上机，使用对应的同型对照组和裸细胞组进行对照。用CD3+CD8+双阳性细胞群设门，标出CD3+CD8+PD-1+全阳性的百分比。数据使用CXP软件进行分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19 进行数据分析。所有数据均以平均值±标准差表示，组间单变量比较使用独立t检验进行比较。当P＜0.05 时，认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞的生长曲线 在培养的0、2、4、6、8 d 分别用CCK-8 试剂盒检测PBMC 的增殖状况。CCK8法检测结果显示经过患者血清刺激的PBMC 在前8 d 随着时间的增加，数量逐渐增加，且在第8 天时实验组数量明显高于对照组（P＜0.05，图1）。

图1 PBMC 培养生长曲线Fig.1 Growth curve of PBMC culture

2.2 上清液炎症因子的检测 未开始刺激（即HBV 刺激的第0 天）时，IFN-γ 和TNF-α 分泌水平均低于检测值下限。在刺激的第8天实验组TNF-α浓 度（1 646.89±149.92）pg∕mL 高于对照组［（1 061.20±151.29）pg∕mL，t= 4.76，P= 0.009，图2］。刺激的第24 天时，实验组TNF-α 浓度（395.67 ±25.17）pg∕mL 低于对照组［（576.33±15.18）pg∕mL，t=-10.65，P= 0.000，图2］。在刺激的第8 天，实验组IFN-γ 的浓度（134.00±15.10）pg∕mL 高于对照组［（24.26±8.22）pg∕mL，t= 11.06，P= 0.000，图3］。在刺激的第24 天，实验组IFN-γ 的浓度（14.05± 1.65）pg∕mL 低于对照组［（20.75±2.47）pg∕mL，t=-3.91，P=0.017，图3］。

图2 各组随着培养天数的改变上清液中TNF-α 的浓度Fig.2 The concentration of TNF-α in the supernatant of each group changed with the number of culture days

图3 各组随着培养天数的改变上清液中IFN-γ 的浓度Fig.3 The concentration of IFN-γ in the supernatant of each group changed with the number of culture days

2.3 CD8+T 细胞上PD-1 的阳性率 未开始刺激时，实验组和对照组CD8+T 细胞上PD-1 阳性率均为（12.23±1.72）%，病毒持续刺激24 d 后，实验组PD-1 表达水平与对照组PD-1 表达水平分别为（16.70±1.65）%、（13.17±2.31）%。实验组刺激24 d后（图4、5）与未开始刺激时（图6、7）相比，PD-1 表达水平升高，差异有统计学意义（P= 0.032）；对照组PD-1 表达水平第24 天（图8、9）与未开始刺激时（图6、7）相比（P=0.605），差异无统计学意义。

3 讨论

全球约有1∕3 的人口都感染过HBV，但不同时期感染出现的结局很可能会不同。婴幼儿期感染HBV 易发展为慢性肝炎，而成年期感染的则只有不到5%的为慢性乙型肝炎，大多数为急性肝炎。目前，HBV 感染慢性化的具体机制仍尚未阐明［6］，慢性乙型肝炎也因此无法实现根治。既往研究［7-8］指出HBV 感染的发病机制主要是免疫介导的，所以相关的免疫效应的研究将可能有利于开辟治疗乙肝的新途径。本次实验通过在体外用免疫耐受期HBV 感染者血清刺激健康人PBMCs 后发现，PBMCs 细胞群在受到HBV 刺激后初期部分免疫细胞能增殖，并且产生炎症因子IFN-γ和TNF-α。但长期刺激后其炎症因子产生能力减弱，且CD8+T细胞表面抑制性受体PD-1 表达上调。

图4 刺激24 d 时的实验组CD3+CD8+细胞群Fig.4 The cell population of CD3+ CD8+ in the experimental group at 24 days of stimulation

图5 刺激24 d 时的实验组CD8+T 细胞上PD-1 阳性率Fig.5 The positive rate of PD-1 on CD8+ T cells in the experimental group stimulated at 24 days of stimulation

图6未开始刺激时CD3+CD8+细胞群Fig.6 The cell population of CD3+ CD8+ without stimulation

图7 未开始刺激时CD8+ T 细胞上PD-1 阳性率Fig.7 The positive rate of PD-1 on CD8+ T cells without stimulation

图8 第24天时的对照组CD3+ CD8+细胞群Fig.8 The cell population of CD3+ CD8+ in the control group on day 24

图9 第24天时的对照组CD8+T 细胞上PD-1 阳性率Fig.9 The positive rate of PD-1 on CD8+T cells in the control group on day 24

HBV 感染引起的应答是由PBMCs 中多种免疫细胞和分泌的相关细胞因子共同参与。当HBV 感染时，乙型肝炎病毒核心抗原、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎病毒e 抗原皆能激活免疫系统［4-5］，继而免疫细胞增殖，并大量分泌IFN-γ 和TNF-α。IFN-γ和TNF-α这两种细胞因子能增强PBMCs 中多种免疫活性细胞的功能，包括抗原的识别、呈递和吞噬等功能。既往研究［9-10］还指出形成特异性免疫的时间是1～2 周。本次实验用免疫耐受期的HBV 感染者血清刺激PBMCs 时，在第8 天时PBMC大量增殖，实验组IFN-γ和TNF-α均明显高于正常组。这说明在8 d 时免疫系统可能被激活。近年来有文献报道［11-12］HBV 感染时，IFN-γ和TNF-α这两种细胞因子可能是通过降解病毒转录和复制模板、干扰HBV 共价闭合环状DNA（HBV covalently closed circular DNA，HBV cccDNA）的完整性和稳定性，继而降低了HBV 的水平，是抑制HBV 复制的关键。当病毒持续刺激时，本研究显示在第24天时实验组IFN-γ和TNF-α均明显低于正常组，表明免疫细胞分泌细胞因子减少，清除病毒功能可能会降低。这与既往研究结果一致：当高病毒载量的HBV 持续存在时，Th1 类细胞因子产生减少，如IFN-γ和TNF-α等细胞因子减少，免疫应答也会减弱［10，12-13］。这也可能是免疫耐受期的HBV 感染者体内有大量HBV，但肝脏不会发生损伤，同时机体也不能清除HBV 的原因。

CD8+T 细胞是有助于清除HBV 的主要免疫细胞，而细胞表面上免疫抑制分子的阳性率与慢性肝炎的发生可能存在相关性［14］。鉴于此，近年来关于CD8+T 细胞上免疫抑制分子的研究越来越多［15-16］。在所有的抑制性受体中关于PD-1 的研究最多。本次研究比较了PBMCs 在受到HBV 持续刺激并出现弱的免疫应答时的CD8+T 细胞的阳性率和未开始刺激时的阳性率，结果表明受到病毒持续刺激的PD-1 阳性率明显升高，这说明慢性HBV 感染者血清的持续刺激会上调HBV 特异性CD8+T 细胞上PD-1 的表达，与先前的研究结果相同［17］。有研究提出PD-1 的阳性率上升的原因可能是由于长期抗原刺激将导致CD8+T 细胞中PD-1启动子的去甲基化，进而造成CD8+T 细胞中PD-1的上调［18］。近期有研究指出PD-1 和PD-L1 之间的相互作用会通过诱导T 细胞凋亡或T 细胞功能障碍导致肝脏免疫耐受［15］。因此，持续感染将导致CD8+T 细胞上PD-1 的阳性率的增加，继而可能导致肝脏免疫耐受、乙肝的慢性化。

既往的体内研究对HBV 发病机制的理解做出了重大贡献，但动物与人类免疫系统的不同导致动物与人在HBV 感染时产生免疫反应的差异，这造成对HBV 感染时机体产生的免疫应答理解的不足［19］。而既往针对HBV 发病机制的体外研究甚少，因此仍需要开展大量的相关研究。本次实验利用免疫耐受期的HBV 感染者血清刺激正常人PBMCs 来研究相关的免疫效应，一方面避免了HBV 感染者血清中IFN-γ、TNF-α等炎症因子对本实验的干扰，另一方面也模拟了人体感染HBV 时的微环境，这些皆使得对HBV 感染过程中免疫应答的研究更加具有应用价值。然而本次研究仍存在一定的缺陷：HBV 引起的免疫应答是由多种免疫细胞和细胞因子共同参与，本研究只观察了HBV 感染时IFN-γ、TNF-α浓度变化，白细胞介素-4、白细胞介素-10 等与乙肝感染有关的细胞因子则未进行研究；CD8+T 细胞上PD-1 的阳性率也只研究了未开始刺激时和刺激24 d 后的阳性率，未研究中间的变化过程。但此次实验依然可反映持续感染与部分炎症因子和CD8+T 细胞上PD-1 阳性率的关系。

既往研究表明HBV 感染时引起的免疫反应可以抑制HBV 复制或以非细胞溶解方式清除HBV［20］。因此，HBV 感染时机体免疫效应的研究将有利于寻找抑制HBV 复制的新方法，甚至将有助于实现世界卫生组织制定的到2030年根治乙型肝炎的目标［21］。