肾衰方及其拆方对肾间质纤维化Wnt4、β-catenin蛋白表达的影响

沈金峰 罗富里 黄伟 晏子友

江西中医药大学（南昌330006）

肾间质纤维化是各类慢性肾系疾病进展终末肾衰竭的的共同病理改变。抑制肾间质纤维化的病理进程是减缓慢性肾脏病进展的主要治疗方法。EMT 参与肾间质纤维化发生的关键步骤，如果能阻断EMT 形成过程，那么可以阻断肾纤维化的进程。Wnt∕β-catenin 信号通路是目前研究细胞EMT调控机制中三条主要通路之一。研究发现Wnt∕β-catenin 信号通路参与慢性肾脏病的发生发展，诱导肾间质纤维化的发展［1］。抑制Wnt4、β-catenin蛋白的表达可能成为治疗肾间质纤维化的靶点。单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠模型是目前研究肾小管间质进行性纤维化较为成熟的一种实验性动物模型［2］。肾衰方是治疗慢性肾脏病常用的临床经验方，我们前期研究己证明其具有抗肾间质纤维化的作用。肾衰方由补虚药物及祛邪药物组成，具有祛邪扶正的作用，利用其复方及拆方可进一步证明肾间质纤维化是否为本虚标实之证。研究采用UUO 诱导肾间质纤维化小鼠模型，观察肾衰方及其拆方对Wnt4、β-catenin 蛋白的表达影响及探讨肾间质纤维化中医是否属于本虚标实之证，为临床上应用肾衰方延缓肾间质纤维化进展提供依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物分组与造模 SPF 级雌性大鼠72 只（购于浙江省医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SCSK（浙）20170001），体质量180～200 g，适应1 周，尿蛋白阴性者方可使用。随机分为：（1）假手术组；（2）模型组；（3）肾衰方组；（4）补虚方组；（5）袪邪方组；（6）贝那普利组，每组12 只。UUO大鼠模型制备参考文献［3］进行，用5.0%水合氯醛（10 mL∕kg 体质）腹腔注药麻醉后，进行输尿管游离，从输尿管上1∕3 与下2∕3 处进行结扎，分层缝合肌肉、皮肤层即制备得UUO 动物模型。假手术组只是分离左侧输尿管但是不予结扎。

1.2 实验用药 肾衰方组（生黄芪30 g、六月雪20 g、生大黄后下10 g、淫羊藿15 g、白花蛇舌草20 g、生地10 g、淮山药15 g、山萸肉10 g、丹参20 g、泽泻10 g、土茯苓20 g、党参15 g 共13 味中药）、补虚方组（生黄芪30 g、党参15 g、生地10 g、山萸肉10 g、山药15 g、淫羊藿15 g 共7味中药）、袪邪方组（生大黄10 g、丹参20 g、白花蛇舌草20 g、六月雪20 g、土茯苓20 g、泽泻10 g 共6 味中药）3组，以上中药都是经过江西中医药大学中药饮片厂专家鉴定后进行采用，将上述中药组进行煎煮，然后进行浓缩，将肾衰方组、补虚方组、祛邪方组分别制成每mL 含生药量1.2 g、0.4 g、0.8 g，4 ℃冰箱保存。盐酸贝那普利（商品名：洛丁新），规格10 mg∕片，批号：H2003014，从北京诺华制药有限公司生产后购买。

兔抗大鼠β-catenin 多克隆抗体、兔抗大鼠Wnt4 多克隆抗体，以1∶100 稀释。Masson 染色试剂盒、DAB 显色试剂盒、免疫组化超敏SP 试剂盒由福州迈新生物技术开发有限公司提供；磷酸缓冲液（PBS）由柠檬酸缓冲液由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

1.3 治疗方法 手术后3 d，各中药组及贝那普利大鼠给药均按10 倍于临床用药剂量折算为等效剂量给药，即肾衰方组、补虚方组、祛邪方组大鼠分别按分别按1.95、0.95、1.00 g∕mL 肾衰方浓缩剂给药，即给药剂分别为19.5、9.5、10.0 g∕（kg·d）进行灌胃；予贝那普利组给贝那普利1.5 mg∕（kg·d）进行灌胃，假手术组、模型组大鼠给等量生理盐水灌胃。术后7、14 d 分别处死各组大鼠。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 一般情况观察 观察各组大鼠食欲、体质量、计算左肾（术侧）湿重、肾脏器系数（肾湿重∕质量×100%）；

1.4.2 24 h 尿蛋白定量测定 处死大鼠前1 d 各组大鼠分别用大鼠金属代谢笼收集24 h 尿液标本，留尿期间禁食，不禁水，记录尿量后取4 mL，2 000 r∕min 离心10 min，去除沉渣并于-20 ℃保存待测。24 h 尿蛋白定量用双缩脲法测定。

1.4.3 肾功能检测 全自动生化仪测定血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、24 h 尿蛋白定量（24 h UP）。

1.4.4 肾组织学检查 大鼠处死后，马上分离梗阻侧肾脏，进行称量重量。用4%甲醛溶液将肾组织全部浸润，使其脱水，用石蜡包埋裹，将其制备成厚度大概为4 μm 切片，再通过HE 和Masson 染色，观察肾脏组织光镜下的改变。

1.4.5 肾小管损伤程度评分及肾小管间质纤维化指数测定 HE 染色评定：运用显微镜（光镜）进行观察（× 400 倍），根据每个视野肾小管病变（肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管扩张、肾小管萎缩、红细胞管型、蛋白管型、间质水肿、间质纤维化、间质炎性细胞浸润等）累及的小管数目评定肾小管间质损伤指数损伤按Banff 分级进行0～3 级半定量计分［4］，0 分：肾小管结构正常，未见病变；1 分：肾小管病变数目＜3 个；2 分：肾小管病变数目3～5 个；3 分：肾小管病变数目＞5 个或肾小管结构消失。Masson 染色半定量分析：在400 倍视野下，每只大鼠选取梗阻侧肾组织5 张切片，每张切片随机选择10 个不相重叠视野的肾小管皮质处，然后计算其平均值［5］。通过观察整个视野中胶原染色阳性面积所占总面积的百分比评判肾间质纤维化指数，评分如下：0 分，纤维化阳性面积＜2%；1 分，纤维化阳性面积2%～10%；2 分，纤维化阳性面积11%～20%；3 分，纤维化阳性面积21%～30%；4 分，纤维化阳性面积＞30%。

1.4.6 免疫组化检测 用SP 法检测实验大鼠肾间质Wnt4、β-catenin 的蛋白表达。每组取6 只（7 和14 d 各6 只）大鼠的术侧肾脏，严格按SP 试剂盒说明进行免疫组化技术操作，用PBS 代替一抗作阴性对照，DAB 显色，苏木素复染。免疫组化结果借助用Image-Pro Plus 5.0 图像分析软件进行计算机图象分析。每张切片随机选取5 个高倍视野（×400），对所选视野内的免疫组化阳性信号经计算机图像分析，通过积分吸光度值反映蛋白表达的高低。

1.5 统计学方法 用SPSS 19.0 软件包进行统计学分析。连续型变量采用均数±标准差进行统计学描述。组间比较采用方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般观察及病理检查 外观性观察：模型组大鼠的皮毛松软、灰暗，消瘦，厌食，少动。肾衰方组、祛邪方组、补虚方组、贝那普利组大鼠的食量、体质量、存活率、活动状况等无明显差异，但比模型组稍好。

肉眼观察：假手术组术侧大鼠肾脏红润、柔软，其7、14 d 时未见明显改变；UUO组大鼠造模术侧肾脏体积大于对侧，颜色变淡，剖面表现出缺血状，肾皮质为尤为明显。肾实质变薄，皮髓质边界模糊不清，肾盂、肾盏扩张，内含尿液，术后7 d 变化不明显，术后第14 d 出现明显变化。模型组及肾衰方组、祛邪方组、补虚方组、贝那普利组大鼠术侧肾脏颜色浅白，表面覆盖一层薄而萎缩样的物质，其内含有液体，肾乳头表现为空洞状，与假手术组相比各治疗组肾湿重降低。非术侧大鼠肾脏术后7、14 d 较假手术组变化不明显。与模型组相比，肾衰方组、祛邪方组、补虚方组、贝那普利组术侧大鼠肾脏颜色、质量、湿度、积液有着不同程度的改善。

各组大鼠左侧肾肾脏器系数（肾湿重∕体质量×100%）比较：与假手术组，同时期模型组左肾脏器指数显著升高（P＜0.05），表明左肾衰竭模型制备成功。与模型组相比，经治疗后，肾衰方及其拆方组和贝那普利组左肾肾脏器指数下降（P＜0.05），其中第14 天肾衰方组大鼠术侧肾肾脏器系数明显低于其他3 个治疗组（P＜0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠术侧肾脏组织Wnt4、β-catenin 蛋白表达比较 如图1、2 所示，假手术组大鼠在肾小球系膜细胞、肾小管细胞见少量Wnt4 蛋白表达，β-catenin 蛋白仅少量表达于肾小管上皮细胞基底侧。造模后各组大鼠Wnt4、β-catenin 蛋白表达明显高于假手术组（P＜0.05），并随着梗阻时间延长，其表达随之增强。经干预治疗后，各治疗组大鼠Wnt4、β-catenin 蛋白表达显著低于模型组，但明显高于假手术组（P＜0.05）；其中肾衰方组明显低于其他3 个治疗组（P＜0.05），见表2。

表1 各组大鼠术侧肾肾脏器系数变化比较Tab.1 Changes of renal and renal organ coefficients in each group of rats ±s

表1 各组大鼠术侧肾肾脏器系数变化比较Tab.1 Changes of renal and renal organ coefficients in each group of rats ±s

注：与同时期模型组比较，*P ＜0.05；同时期与各治疗组比较，#P＜0.05；14 d 时与其他3 个治疗组比较，△P＜0.05

组别假手术组模型组肾衰方组祛邪方组补虚方组贝那普利组天数（d）7 14 7 14 7 14 7 14 7 14 7 14体质量（g）197.27±13.41 210.10±12.51 217.60±11.63 250.32±17.04 200.75±9.80 220.73±19.94 202.61±7.53 223.92±13.27 205.82±9.01 231.52±19.95 207.10±7.22 237.21±18.73左肾重（g）1.77±0.18 2.30±0.21 1.15±0.18 1.39±0.076 1.41±0.090 2.05±0.25 1.37±0.093 2.01±0.091 1.31±0.063 1.92±0.096 1.29±0.057 1.85±0.061左肾器官指数（%）0.61±0.05#0.63±0.03#1.70±0.13*2.10±0.27*1.03±0.17 1.32±0.10△1.39±0.23 1.74±0.35 1.40±0.14 1.68±0.27 1.36±0.24 1.58±0.27

表2 各组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin 蛋白表达Tab.2 Expression of Wnt4 and beta-catenin in renal tissues of rats in each group ±s

表2 各组大鼠肾组织Wnt4、β-catenin 蛋白表达Tab.2 Expression of Wnt4 and beta-catenin in renal tissues of rats in each group ±s

注：与同时期模型组及各治疗组比较，*P＜0.05；与同时期各治疗组比较，#P＜0.05；与同时期其他治疗组比较，△P＜0.05

组别假手术组模型组肾衰方组祛邪方组补虚方组贝那普利组天数（d）7 14 7 14 7 14 7 14 7 14 7 14 Wnt4 1.2±0.32*3.10±0.88*7.88±1.56#10.05±1.23#4.10±0.89 5.10±0.66△5.22±0.76 6.58±1.20 4.62±0.91 6.91±0.81 5.63±0.76 6.88±0.69 β-catenin 3.0±0.58*4.30±0.66*8.54±1.32#13.62±0.77#4.54±0.66 5.48±0.59△6.10±0.88 8.35±1.13 6.13±1.74 8.78±1.44 5.98±1.23 8.11±1.45

2.3 各组大鼠BUN、Scr、24 h UP 水平比较 与假手术组相比，模型组Scr、BUN 水平和24 h UP 升高（P＜0.05），经肾衰方、祛邪方、补虚方及贝那普利治疗后均有所改善（P＜0.05），14 d 肾衰方在降低Scr、BUN 水平和24 h UP 优于祛邪方、补虚方及贝那普利，表明肾衰方可以改善UUO 大鼠的肾功能及降低尿蛋白的作用，保护肾脏。见表3。

图1 Wnt4 免疫组化结果Fig.1 Immunohistochemical results of Wnt4

图2 β-catenin 免疫组化结果Fig.2 Immunohistochemical results of β-catenin

表3 各组大鼠血清SCr、BUN 水平和24 h UP 的比较Tab.3 SCr、BUN and 24 h UP data of rats in each group ±s

表3 各组大鼠血清SCr、BUN 水平和24 h UP 的比较Tab.3 SCr、BUN and 24 h UP data of rats in each group ±s

注：与同时期模型组及各治疗组比较，*P＜0.05；与同时期各治疗组比较，#P＜0.05；与同时期其他治疗组比较，△P＜0.05

组别假手术组模型组肾衰方组祛邪组补虚组贝那普利组BUN（mmol∕L）7 d 6.21±1.46*11.12±1.42#8.10±0.41 9.66±0.87 9.42±0.79 8.26±0.54 14 d 7.56±1.26*12.48±1.56#5.88±0.76△6.92±0.82 6.88±0.77 6.11±0.85 SCr（μmol∕L）7 d 25.38±4.42*60.46±10.54#40.43±5.28△50.29±7.22 51.28±8.38 44.76±6.10 14 d 31.73±5.28*67.32±14.24#39.86±4.80△49.31±6.21 49.47±9.64 45.63±2.61 24 h UP（mg）7 d 3.10±1.01*10.54±3.26#8.39±1.39 9.84±1.21 9.48±1.58 9.83±1.06 14 d 4.05±1.42*13.67±2.52#5.72±0.48△8.10±0.70 8.26±0.83 6.91±0.88

2.4 大鼠肾脏病理改变 如图3所示，HE 染色见假手术组大鼠肾小球、肾小管结构清晰，肾小管排列紧密，肾小管周围间质无增宽；模型组大鼠术后第7 天起观察到肾小管管腔扩张，肾小管周围间质增宽、水肿并伴有大量炎性细胞浸润，随梗阻时间延长更加严重。但梗阻早期（术后第7 天）肾小球结构相对完整，各治疗组大鼠较同期模型组上述病变有所改善。与假手术相比模型组肾小管损伤程度显著升高（P＜0.05），经肾衰方、祛邪方、补虚方、贝那普利治疗后肾小管损伤程度与模型组比较显著降低（P＜0.05），且第14 天肾衰方组大鼠肾小管损伤程度评分低于其他3 个治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05）。如表4、图4所见，Masson染色见假手术组大鼠肾小球基底膜、系膜区及肾小管间质无明显胶原沉积；模型组大鼠肾组织可见条索状胶原，呈蓝紫色，梗阻时间越长越明显。模型组较假手术组胶原沉积显著升高（P＜0.05），肾衰方组、祛邪方组、补虚方组、贝那普利组与模型组比较均下降（P＜0.05），且第14 天肾衰方组肾小管间质纤维化指数明显低于其他3 个治疗组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 各组大鼠肾小管损伤程度评分及肾小管间质纤维化指数Tab.4 HE and Masson scores in each group of rats x±s

3 讨论

笔者认为肾间质纤维化的病机归纳为“虚”、“湿”、“瘀”、“毒”四个方面，“虚”是始因，湿、瘀是肾间质纤维化微型癥积形成的病理基础，而毒促进肾间质纤维化的进展。肾间质纤维化为本虚标实之证，治疗需标本兼顾，但不同时期各有侧重。在早期，标实为主，以祛湿泄浊，活血化瘀为法，到了晚期，正气耗伤，当以扶正为主，补益脾肾，泄浊解毒。病机关键是“脾肾亏虚、湿浊内蕴，瘀毒闭阻”，故治疗以益肾健脾、化瘀利湿、解毒泄浊为法。肾衰方正是依据此病机研制而成，由生黄芪、生地、党参、山萸肉、淮山药、丹参、泽泻、土茯苓、白花蛇舌草、蒲公英、六月雪、生大黄、淫羊藿组成，具有标本兼顾的作用。肾衰方为参芪地黄汤化裁而来。方中用丹参换丹皮提高起活血化瘀的作用，人参用党参替代以补益中气，党参配黄芪益气健脾，生地滋养阴血、山萸肉补益肝肾、山药固肾健脾、淫羊藿温肾助阳，以上诸药可益气健脾固肾，顾护其本；佐以生大黄，通脏腑，泄浊毒、利瘀水，使浊毒从肠胃而出，白花蛇舌草、蒲公英解毒利水、六月雪健脾利湿，泽泻活血利水、茯苓健脾渗湿，全方健脾益肾而祛浊毒，降浊毒而耗伤正气，补中寓泻，泻中有补，以标本共奏的功效。补虚方组（生黄芪、党参、生地、山萸肉、山药、淫羊藿）、袪邪方组（生大黄、丹参、白花蛇舌草、六月雪、土茯苓、蒲公英、泽泻），通过拆方进行治疗，进一步佐证肾间质纤维化是否为本虚标实之证。

图3 各组大鼠肾组织HE 染色结果Fig.3 HE staining in renal tissues of rats in each group

图4 各组大鼠肾组织Masson 染色结果Fig.4 Masson staining in renal tissues of rats in each group

Wnt∕β-catenin 是一种进化保守、高度复杂信号通路［6］。Wnt 信号通路主要的生理功能是按程序规律地激活和静止，它分泌的糖脂蛋白，是生物正常组织分化的诱导信号［7］。β-catenin 作为经典Wnt 信号通路的核心蛋白，参与细胞代谢的增殖、分化和凋亡过程，具有介导细胞间黏附和参与基因表达的功能［8］。β-catenin 作为一种细胞骨架蛋白［9］。β-catenin 又是Wnt4 信号途径下游的关键效应因子，Wnt 信号途径能引起胞内β-catenin 积累。正常机体肾脏中wnt4、β-catenin 信号是相对沉默。Wnt4 信号途径广泛参与肾脏疾病的发生和发展，特别是在肾间质纤维化［10］。激活Wnt 信号在肾间质纤维化的发病机制至关重要［11］。慢性肾病大鼠肾组织的β-连环蛋白和细胞凋亡相关蛋白的表达水平升高，β-catenin 沉默可能是一种有治疗对肾纤维化疾病的干预策略［12］。越来越多的证据表明，持续激活Wnt∕β-catenin 与肾纤维化病变有着密切的联系［13］。通过抑制Wnt∕β-catenin 信号转导通路可能为治疗肾纤维化提供新的突破口和干预靶点。

本实验以贝那普利作为对照组，进一步观察肾衰方对大鼠肾间质纤维化的作用。贝那普利为目前公认具有抗肾间质纤维化作用的药物。从实验结果中，本研究发现肾衰方及其拆方和贝那普利都能抑制Wnt4、β-catenin 蛋白的表达，改善肾小管损伤程度及减轻肾小管纤维质指数，改善肾功能，减轻肾脏损害，延缓慢性肾脏病进程，提示肾衰方及其拆方和贝那普利具有保护肾脏作用。且肾衰方抑制肾间质纤维化效果优于补虚方、祛邪方，可见单纯补虚或单纯祛邪抗肾间质纤维化效果不佳，从肾衰方及其拆方的治疗效果也进一步佐证了肾间质纤维化属于本虚标实之证，在治疗上需标本同顾，方能起到较好治疗效果。

中药肾衰方抗肾间质纤维化作用机制可能是通过抑制Wnt4、β-catenin 蛋白的表达，延缓肾间质纤维化进展，改善肾功能，其中医属于本虚标实之证。