响应面法优化无花果果汁酶解提取工艺研究

孙小华，马艳弘，崔 晋，韩德果，程 果，窦泓喆，杨国慧 (东北农业大学 园艺园林学院，黑龙江 哈尔滨 50030； 江苏省农业科学院 农产品加工研究所，江苏 南京 004)

[摘 要] 【目的】 研究双酶法提取无花果汁的最佳工艺参数，为制备无花果汁、酿造无花果酒奠定基础。【方法】 以无花果为材料，以出汁率为考察指标，通过单因素试验和响应面试验，研究纤维素酶和果胶酶添加量、酶解温度、酶解时间4个因素及其交互作用对无花果岀汁率的影响，利用响应面试验结果建立回归方程，并对回归方程进行显著性和方差分析，得到无花果果汁酶解提取最佳工艺参数并进行试验验证。【结果】 通过单因素试验得到的无花果果汁最佳酶解提取条件为：纤维素酶添加量1.5%(质量分数，下同)，果胶酶添加量0.3%，酶解温度55 ℃，酶解时间90 min。根据单因素试验结果进行响应面试验分析得出，无花果果汁的最佳酶解提取工艺条件为：纤维素酶添加量1.56%，果胶酶添加量0.28%，酶解温度53 ℃，酶解时间90 min；在此条件下无花果的岀汁率为72.15%，与理论值(73.99%)基本吻合，且比未处理无花果出汁率提高了75.46%。纤维素酶添加量与酶解温度和酶解时间、果胶酶添加量与酶解温度和酶解时间、酶解温度与酶解时间的交互作用均可在较大程度上影响无花果的岀汁率。【结论】 通过响应面试验得到了双酶法提取无花果汁的最佳工艺参数，该工艺可以大幅提高无花果出汁率。

无花果(FicuscaricaL.)，别名天仙果、明目果、映日果、奶浆果[1]，为桑科无花果属多年生木本植物，其根、茎、叶、果实均可入药，为典型的药食两用型水果，具有很高的营养价值和药用价值，被誉为“生命之果”、“神圣之果”[2]。无花果不仅含有多种维生素、糖类、蛋白质、脂肪、粗纤维等营养成分，还富含多酚类物质、花青素、活性多糖等成分，具有很强的抗氧化、抗衰老、保护心血管、抗癌、增强免疫力等药理保健功效[3]，在国内外市场极其畅销。无花果为呼吸跃变型果实，成熟衰老快，皮薄汁多，含糖量高，耐贮藏性差，货架期短，极易腐烂变质[4]。采用现代生物加工技术，开发营养保健的无花果果酒、果汁饮料等高附加值产品,成为解决无花果产业发展瓶颈的主要途径[5]。

王鹏[6]以新疆当地的鲜无花果为原料，采用果胶酶酶解技术，利用单因素试验结合正交试验优化无花果酶解工艺，最佳条件为：果胶酶添加量0.6%,酶解温度50 ℃,酶解时间60 min。这是目前国内外仅有的关于无花果酶解工艺的研究报道，但该研究仅利用果胶酶来酶解无花果，且研究对象仅是新疆当地的无花果。江苏太湖作为果业发达地区，具有不同于新疆的无花果品种，且人口众多，产业发展前景广阔。在无花果加工取汁时，由于其果浆中含有大量纤维素和果胶，使得果浆黏度增加[7-8]，导致出现原料压榨性能差、利用率低、果酒生产成本高等问题。据报道，利用生物酶解技术能有效分解细胞壁、细胞膜的纤维素和果胶等物质，降低果浆黏度，进而提高果品出汁率，降低果酒生产成本[9]。基于此，本研究以江苏苏州西山国家现代农业示范园的“玛斯义陶芬”无花果为原料，以果胶酶和纤维素酶酶解为技术手段，以出汁率为考察指标，通过单因素试验和响应面试验，研究纤维素酶和果胶酶添加量、酶解温度、酶解时间等因素对无花果出汁率的影响以及各因素之间的交互作用，确定酶解制备无花果果汁适宜的工艺条件，以期为无花果的加工利用尤其是果酒开发提供理论依据和试验参数。

1 材料与方法

1.1 材 料

试材：无花果采摘于江苏苏州西山国家现代农业示范园区有限责任公司无花果种植基地，品种为“玛斯义陶芬”，八成熟，采摘后置于-20 ℃冰箱中备用。

试剂：纤维素酶(活力≥400 U/mg)、果胶酶(活力≥500 U/g)，均购于上海瑞永生物科技有限公司。

仪器：MJ-BL15U11型打浆机，广东美的生活电器制造有限公司；ML204型电子分析天平，梅特勒-托利多(上海)有限公司；DK-8D型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；TGL-16B台式离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 无花果果汁酶解提取的单因素试验和响应面试验

1.2.1 单因素试验 取适量无腐烂、无破损、成熟程度一致的无花果解冻后洗净，打浆成无花果浆后，以纤维素酶添加量、果胶酶添加量、酶解温度、酶解时间为因素进行试验，考察其对无花果出汁率的影响。

(1)纤维素酶添加量的影响。将无花果浆分装成7等份，每份50 g，均加质量分数0.5%的果胶酶，再分别添加0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%(均为质量分数，下同)的纤维素酶并搅拌，45 ℃水浴锅中酶解90 min，90 ℃水浴锅中灭酶5 min，4 500 r/min离心20 min，取上清液，计算出汁率。

(2)果胶酶添加量的影响。将无花果浆分装成7等份，每份50 g，均添加2.0%的纤维素酶，再分别添加0，0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%，1.1%(均为质量分数，下同)的果胶酶并搅拌，45 ℃水浴锅中酶解90 min，90 ℃水浴锅中灭酶5 min，4 500 r/min离心20 min，取上清液，计算出汁率。

(3)酶解温度的影响。将无花果浆分装成7等份，每份50 g，均添加2.0%的纤维素酶和0.5%的果胶酶，分别在35，40，45，50，55，60，65 ℃水浴锅中酶解90 min，90 ℃水浴锅中灭酶5 min，4 500 r/min离心20 min，取上清液，计算出汁率。

(4)酶解时间的影响。将无花果浆分装成7等份，每份50 g，均添加2.0%的纤维素酶和0.5%的果胶酶，在45 ℃水浴锅中分别酶解30，60，90，120，150，180 min，90 ℃水浴锅中灭酶5 min，4 500 r/min离心20 min，取上清液，计算出汁率。

1.2.2 响应面试验 根据单因素试验结果，以纤维素酶添加量、果胶酶添加量、酶解温度、酶解时间为因素，以岀汁率为响应值，采用Box-Benhnken中心组合设计进行四因素三水平试验[10-11]，其因素与水平见表1。采用Design-Expert 8.0.6软件对响应面试验数据进行分析，确定最佳酶解条件。

表1 无花果果汁酶解提取工艺的响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of RSM test for enzymolysis extraction of fig juice

1.3 数据处理

无花果出汁率=(无花果上清液质量/无花果果浆质量)×100%[6]。

所有试验均做3次平行，结果取平均值，试验数据采用EXCEL软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 无花果果汁酶解提取工艺的单因素试验结果

2.1.1 纤维素酶添加量的影响 如图1所示，当纤维素酶添加量在0～1.5%时，无花果出汁率随着纤维素酶添加量的增大而升高，且在纤维素酶添加量为1.5%时出汁率最高，达到70.8%；当纤维素酶添加量大于1.5%时，出汁率变化趋于稳定。这可能是因为一定量的纤维素酶酶解破坏了细胞壁结构，细胞内容物溶出，导致出汁率提高[12]；但当纤维素酶添加量达到最佳值后，细胞内容物已经充分溶出，出汁率达到最大，再继续提高加酶量时，出汁率也不再提高[13]。因此，确定1.5%为适宜的纤维素酶添加量。

2.1.2 果胶酶添加量的影响 如图2所示，果胶酶添加量在0～0.3%时，无花果出汁率随着果胶酶添加量的增大而升高，且在果胶酶添加量为0.3%时出汁率达到最高(67.71%)；当果胶酶添加量大于0.3%时，出汁率随着纤维素酶添加量的增加而缓慢下降。这可能是因为当果胶酶添加量达到最佳值时，细胞内容物已经充分溶出，出汁率达到最大，此时继续提高加酶量，出汁率不再提高[14]。因此，确定果胶酶添加量以0.3%为宜。

图1 纤维素酶添加量对无花果岀汁率的影响Fig.1 Effect of cellulase addition amount on fig juice yield

2.1.3 酶解温度的影响 如图3所示，当酶解温度在35～55 ℃时，无花果出汁率随着温度的升高而增加，且在55 ℃时出汁率最高(71.09%)；当温度高于55 ℃时，出汁率随着温度升高而下降。这是由于纤维素酶和果胶酶的活性具有最适合的温度，在一定温度范围内，酶活性会随着温度升高而提高；到最适温度时，酶活性最高,催化能力最强[15]；当温度高于最适温度时，酶活性降低，酶解反应受到抑制，致使岀汁率有所降低[14]。因此，确定酶解温度以55 ℃为宜。

2.1.4 酶解时间的影响 如图4所示，当酶解时间在30～90 min时，无花果出汁率随着时间的延长而升高，且在90 min时出汁率最高(68.12%)；超过90 min时，出汁率随着时间的延长而下降。这可能是因为随着时间延长，酶活力得到充分发挥，酶解反应较完全，出汁率不断升高；在最适宜的时间酶促反应彻底，出汁率达到最高值；超过最适宜时间则纤维素果胶类物质基本分解完毕，酶解反应基本结束，出汁率不再增加而逐渐趋于平缓甚至略微下降[15]。因此，确定90 min为适宜的酶解时间。

图3 酶解温度对无花果岀汁率的影响Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on fig juice yield

2.2 无花果果汁酶解提取工艺的响应面试验结果

2.2.1 响应面试验结果与模型建立 在单因素试验结果基础上，利用Design-Expert 8.0.6中的Box-Benhnken中心组合设计无花果酶解工艺优化响应面试验，试验结果如表2所示。对表2中数据进行多元回归拟合分析，得到以出汁率(Y)为响应值的回归方程：

式中：Y为出汁率，X1、X2、X3、X4分别为纤维素酶添加量、果胶酶添加量、酶解温度、酶解时间的变量值。

表2 无花果果汁酶解提取工艺的响应面试验结果Table 2 Design and results of RSM test for enzymolysis extraction of fig juice

表2(续) Continued table 2

表3 无花果果汁酶解提取工艺回归方程的方差分析Table 3 Variance analysis on regression equations for enzymolysis extraction of fig juice

2.2.3 响应面分析 由图5可以看出，在6个交互项中，任何2个交互因素的响应面都存在最高点，纤维素酶添加量(X1)与酶解温度(X3)、纤维素酶添加量(X1)与酶解时间(X4)、果胶酶添加量(X2)与酶解温度(X3)、果胶酶添加量(X2)与酶解时间(X4)、酶解温度(X3)与酶解时间(X4)的响应面曲面坡度均较陡峭，说明两者的交互作用对无花果出汁率的影响极显著。

图5 因素的交互作用对无花果出汁率的影响Fig.5 Effect of the interaction of factors on the juice yield of figs

2.2.4 验证试验 通过软件Design Expert 8.0.6求解回归方程，得出最优的理论酶解条件为：纤维素酶添加量1.56%、果胶酶添加量0.28%、酶解温度53.37 ℃、酶解时间89.54 min，此条件下无花果的理论岀汁率为73.99%。为了检验工艺的可靠性，考虑到实际操作方便，将最优酶解条件适当修正为：纤维素酶添加量1.56%，果胶酶添加量0.28%，酶解温度53 ℃，酶解时间90 min，进行3次平行试验，得出无花果的实际岀汁率为72.15%，与理论预测值吻合，说明根据该模型得到的最优酶解条件是可行的。经测未经酶解处理的无花果岀汁率为41.12%，酶解最佳工艺条件下的理论岀汁率较之高79.94%，实际岀汁率较之高75.46%，说明该酶解工艺可以有效地提高无花果岀汁率。

3 讨 论

本研究系统分析了纤维素酶和果胶酶添加量、酶解温度、酶解时间对无花果岀汁率的影响，结果表明，随着纤维素酶和果胶酶添加量的增加、酶解温度的升高和酶解时间的延长，无花果岀汁率总体上呈先增长后持平的趋势。主要原因如下：其一，纤维素与果胶作为纤维素酶和果胶酶的底物，它们是构成无花果细胞壁的重要成分，因此不断添加纤维素酶和果胶酶会破坏细胞壁结构，使细胞内容物不断溶出直至溶出几乎完毕，从而导致出汁率由不断增大到不再上升；其二，在适宜的温度范围内，酶具有高活性，超越了适宜温度范围时，则高活性受到抑制，因此酶解反应中出汁率亦会出现先增长后持平的现象；其三，在适宜时间内酶解反应高效，时间太久时反应几乎会消耗所有的底物，导致细胞内容物基本释放完毕，酶解反应趋于结束。在单因素试验基础上通过响应面试验建立了可靠的预测模型，优化了最佳的酶解工艺，在最佳条件下的出汁率与理论值拟合度很高，说明此工艺参数可靠。与不经过酶解的无花果相比，利用优化的酶解工艺岀汁率提高了75.46%。本研究与王鹏[6]的研究结果存在一定的差异，其原因在于不同的无花果品种及其特性不同，且受生态环境的影响；另外，酶活力规格不同，研究结果也会有所差异。

在无花果的酶解工艺优化研究领域中，本研究使用了纤维素酶和果胶酶2种酶优化无花果的酶解工艺，打破了前人仅利用果胶酶进行酶解工艺研究的局限性。由于纤维素酶和果胶酶均为特异性酶，造成无花果细胞可破解的多糖种类增加，这不但有利于提高出汁率，而且增加了酵母酒精发酵可利用的碳源，一定程度上提高了酒精度，有利于无花果的酿酒产业发展[17]；另外，利用纤维素酶协同果胶酶酶解无花果可以更大程度地保证食物的消化吸收[18]。

4 结 论

本研究通过响应面试验优化双酶法提取无花果汁的工艺条件，得出其酶解最优工艺条件为：纤维素酶添加量1.56%、果胶酶添加量0.28%、酶解温度53 ℃、酶解时间90 min。此条件下无花果的出汁率高达72.15%，比未经酶解处理的无花果出汁率提高了75.46%，可见利用双酶法可显著提高无花果出汁率，有利于降低无花果的加工成本。